各位小伙伴，大家還記得當初進實驗室的時候接觸到的個實驗技能是什么呢？沒錯，是 PCR 擴增。小編曾經也是，看著自己親自配比 PCR 克隆擴增的每個組分，親眼看著瓊脂糖凝膠在紫外透光臺上發出的幽綠色的熒光，也是深深被迷住。但總不可能成天就對著這個邪魅的熒光發呆，對吧？看久了，她會愛上你的眼睛，把你眼睛據為己有的，說白了，就是眼睛看紫外看多了，瞎了。因此，小編也是不得不接著往下做著實驗，從此也展開了慢慢苦逼的生物科研道路。
今天小編要來分享的可不是 PCR 擴增，相信在實驗室摸爬滾打飽經風霜的小伙伴閉著眼睛都知道怎么做。小編今天要給大家分享的是我們的第二個實驗技能。是的，你沒想錯，就是分子克隆實驗。可能這時候實驗室的老鳥會問，小編你講分子克隆有什么意思啊，這個實驗太基礎了，我閉著眼睛也會做，沒什么技術含量啊。可是小編想說，分子克隆作為實驗室的基礎實驗，相比于 NGS、Crisp9 這些高端實驗確實簡單，甚至比 Western blot、qPCR 這些基礎實驗還要簡單。但是，它作為大部分研究課題的實驗開展的基礎，甚至關系到整個實驗的進展與成敗。況且，這個簡單實驗里面還有你不知道的秘密呢！要不，跟著小編一個一個來看看？
分子克隆實驗原理：分子克隆指將我們的目的基因片段用體外重組的方式插入到克隆載體中，形成重組克隆載體。利用轉導轉化的方式導入宿主
細胞中進行表達，利用宿主細胞對載體的復制和擴增，從而獲得大量的目的片段拷貝。
分子克隆的實驗流程： 小編啊，這些我們都懂，哪是什么秘密呢？別急，小編只是怕你們實驗做多了，有點兒忘了，給大家溫故一下。下面開始敲黑板劃重點。
你不知道的限制性內切酶：
1、保護堿基的選擇和添加和限制性內切酶的用量限制性內切酶是一種能夠識別特定核苷酸序列序列并在識別位點的固定位置進行切割的一類酶，其切割后產物形成粘性末端或者平末端。廣泛用于分子克隆載體構建等實驗。但我們別小看這個酶，她的脾氣還挺大的。小伙伴們有沒有發現，大家有時候做實驗，明明這段序列用特定的內切酶切割過夜都不能夠切開？這是為什么呢？因為你「錢」沒給夠啊，不給錢，別人憑啥幫你辦事兒啊。什么是限制性內切酶的「錢」呢？那我們不得不提到一個東西——保護堿基。我們都知道，在我們設計引物的時候，除了在引物的 5’添加限制性內切酶以外，還需要額外添加 1-3 個堿基，這就是我們所說的保護堿基。它的作用是能夠使得限制性內切酶在識別了特定的核苷酸序列后能夠更好的附著在序列上對序列進行切割，相當于一個起到支撐作用的骨架。每個限制性酶都有對應的保護堿基添加原則，并且保護堿基越多，對酶的穩固作用越強，酶活性越好。這就是所謂的拿「錢」辦事兒，「錢」給夠了，事兒自然就辦好了。那我怎么知道這個保護堿基該如何添加呢？別急，小編已經將不同限制性內切酶保護堿基情況整理成表格放在文末了，各位有需要的小伙伴可以到文末查閱。
又有小伙伴問，我保護堿基也添加了，酶切時間也足夠長，為什么有時候還是不能夠將
質粒切開呢？這里，小編悄悄告訴大家，其實有的時候也不是拿「錢」就一定能辦好事兒，遇到困難的事情，「錢」是解決不了的，需要靠眾人的力量。不同的質粒可能存在多種復雜的高級結構，像缺刻、超螺旋等。有的限制性內切酶并不能夠完全應對這些復雜的高級結構，需要加大酶的使用量或者配合其他能夠適應質粒高級結構的酶進行雙酶切才能夠確保這些酶能夠完成切割。只是，對于應對高級結構不同的酶所需要添加的酶量，小編目前也還在進行驗證，到時候一定會將常見的酶種類分享給大家。
2、限制性內切酶和質粒的甲基化小編之前說過，限制性內切酶脾氣很大，遇到「不開心的事兒」她就會罷工。同樣地，當限制性內切酶遇到了甲基化的質粒，她也就這樣悄無聲息地罷工了，留下實驗失敗的你獨自流淚。
甲基化是細菌用來保護自己的基因序列不被自身合成的限制性內切酶所切割，是細菌的一種自我保護機制。常見的甲基化包括了 Dam+、Dcm+、EcoKI+、EcoBI+ 以及真核細胞中的 CpG 等。同理，不同的甲基化也能夠識別特定的序列，從而在特定的堿基上進行。如果當限制性內切酶所識別的序列與甲基化識別的序列相同或者重疊時，限制性內切酶將不能夠切開該位點序列（見表二）。另外，還需注意一點，我們實驗所采用的大腸桿菌是否是屬于上述甲基化的陽性菌株，如果是，恭喜你，實驗失敗很正常，懵逼樹下的懵逼果等你去嘗嘗。所以，快去看看文末你所用的限制性內切酶是否和甲基化的識別序列重合，你的克隆菌株是否是甲基化的陽性菌株吧。
小編幫你們列出的常見 41 種內切酶的表格中可能收到甲基化影響的限制性內切酶的種類，其中橙色標注的表示該酶的識別序列與所對應的甲基化的識別序列相同，當存在該種類甲基化的時候，限制性內切酶的功能將會被抑制；藍色標注的表示該酶的識別序列與所對應的甲基化的識別序列有部分重疊，需要具體看酶切位點序列相鄰部分是否存在特定的堿基，使得與該酶對應的甲基化序列相同，如果不同，則不受到甲基化的影響；綠色標注的表示該酶只有在真核生物中才會收到甲基化的影響。所以，大家以后遇到類似的問題，多思考思考是否存在甲基化的影響呢！
等等！你們可能發現了，小編你是不是說漏了一個。表中不是還有一個紅色標注的嗎？那個又是怎樣一個情況呢？嗯！這都被你們發現啦。是的，這里面存在一個特殊的酶——DpnI，這個酶也是馬上小編要告訴大家的另一個秘密。我們看看怎么回事吧！
不用酶切，PCR 也可以幫你完成分子克隆：
1、反式 PCR我們都知道，在做分子克隆的時候，必須要用限制性內切酶將環狀質粒切割成為線性，才能夠連接我們的目的片段。那么，大家有沒有想過，在我們的酶切位點兩頭，以質粒為模板設計引物，反向直接擴增我們的質粒呢？這樣的質粒天生就是線性化的質粒，而且無需進行搖菌培養質粒提取和酶切等復雜的操作。這就是我們所說的反式 PCR。是不是很簡單？對，就是這么簡單到你懷疑人生。但有一個問題來了，整個反應體系中的模板即我們原來的環狀質粒，如果在進行克隆連接的時候豈不是也被導入到宿主細胞中表達，也就是說我們挑菌的時候也是有概率會挑到這些空載載體的！如何解決？接著看就明白了。
2、DpnI 切割反式 PCR 中的環狀質粒之前小編在甲基化中提到過，我們還有一個特殊的限制性內切酶沒有提到，它就是 DpnI。這個酶之所以特殊，其原因在于它不同于其他的限制性內切酶，它只有當存在 GATC 序列被甲基化的時候才能夠發揮它的活性，進行完全的切割，也就是說它和其他受到甲基化影響的酶是相反的。甲基化只有在甲基化陽性的原核或者真核生物中才能夠存在。所以，當我們用 Dam+菌株提取的質粒進行反式 PCR 的時候，為了降低后期克隆實驗的空載率，我們需要使用 DpnI 來消化我們原來用于模板擴增的環狀質粒，由于質粒上存在多個 GATC 甲基化的序列，因此，DpnI 能夠將原來環狀質粒直接切割成多條片段，另外，PCR 擴增的線性質粒并沒有在原核生物體內進行過甲基化，因此線性質粒的序列不會被 DpnI 識別切割，從而達到我們分離環狀質粒和線性質粒的需求。這里需要提醒下小伙伴們，如果你們的質粒模板是從 Dam-菌株里面提取的，那么以上的方法就不再適用了！至于原因，大家可以想一想，小編就不在這里贅述了。
關于限制性內切酶，目前已經商業化的品種已經兩百多種，作為目前世界排名靠前的內切酶生產商，莫納生物對這類基礎工具酶已經研究探索多年，為了打破國外四十多年的壟斷地位，繞過保護，莫納生物自主研發了全新的內切酶生產工藝，目前在售的快速內切酶已經四十多種（持續增長中），現階段已經基本滿足常規的生物學實驗需求。
都 9102 年了，你還在用傳統的方法做克隆？克隆虐我千百遍，我待克隆如初戀。做個克隆，至少需要兩天的時間，還要忙前忙后準備一大堆需要的東西。麻不麻煩，累不累啊！有這個時間，我多看兩篇文獻，多編兩行 Python 代碼不好嗎？小編說過，越基礎的實驗越是需要牢固掌握，但同樣越是基礎的實驗越是需要我們節省時間，提高效率。
無縫克隆在幾年前可能是個陌生的詞匯，但隨著國內外各大品牌廠商的開發與成熟，你敢說你還沒聽過這樣一個神奇的實驗？莫納生物也有自主研發的無縫克隆
試劑盒喲，接下來小編就給大家科普一下。
1、什么是無縫克隆，它的原理是什么？無縫克隆又叫同源重組，它可以將單個至多個片段同時插入到一個載體中，而不需要進行多次的酶切和純化。通常情況下，無縫克隆可以在 5-15 min內完成多個片段的連接，其克隆陽性率高達 98% 以上。但需要注意的是，我們在無縫克隆前進行 PCR 擴增的時候，載體與片段之間、片段與片段之間需有 15-20 堿基的一段同源序列，這是為什么呢？因為我們無縫克隆的試劑盒里面存在三種酶，分別是 T5 核酸外切酶、DNA 聚合酶、DNA 連接酶。其中 T5 核酸外切酶具有 5’-3’核酸外切酶的活性，能夠將序列從 5’-3’開始降解，此時暴露出載體以及片段的3’同源序列，經過堿基互補配對，DNA 聚合酶添加缺失堿基后由 DNA 連接酶將片段與載體進行連接，從而達到載體重組的功能。因此，如果不添加同源序列，載體與片段、片段與片段之間將無法進行連接。
2、無縫克隆引物設計大家現在對無縫克隆已經有一個深入的了解了，那么我們來看看，在做無縫克隆之前，跑 PCR 的時候引物設計有哪些要求呢？
引物添加的順序 5’-3’：
同源序列+特異性引物（克隆后無需進行酶切，適用于表達載體）
同源序列+保護堿基+酶切位點+特異性引物（克隆后還需要進行酶切或者亞克隆）這里需要提醒大家注意一下，由于無縫克隆的引物在普通 PCR 的引物基礎上添加了額外的附加堿基（同源序列、保護堿基、酶切位點），Tm 值可能會較常規引物的高。但我們在做 PCR 的時候，、二次循環，幾乎只有特異性引物的序列與模板結合，此時應該只計算特異性引物的 Tm 值，否則會出現退火溫度過高，PCR 擴增不出條帶。但后面的循環，特異性引物和附加堿基均能夠和、二次擴增產物為模板進行結合擴增，并占據絕對優勢。此時引物 Tm 值應該按照整條引物的 Tm 值計算。因此，在做無縫克隆前的 PCR 擴增時，建議大家在第二個循環后提高退火溫度進行 PCR 擴增，更有利于產物的形成。
3、無縫克隆的連接時間的選擇雖然說，無縫克隆帶給我們很多的便利，但小編需要告訴大家需要注意一點兒的是，無縫克隆連接的片段數量有限，一次連接超過 6 個或者載體+片段超過 13 Kb 后，其連接時間會增加且陽性率會降低，甚至出現實驗失敗的情況。因此，在做無縫克隆實驗的時候需要多多計算一下。
結束語：看了這么多，是不是發現，原來一個小小的分子克隆實驗還有這么多的學問？還有好多自己不知道的秘密。其實，大家做實驗的時候，不要僅僅停留在它的一個表面，認為它只是一個再基礎不過的東西，深入探索一下會發現里面其實還有很多有趣的事情和講究，這里面只是告訴了大家一些比較實用的方法和技巧，更深層次的東西大家下來可以慢慢摸索。祝大家實驗順利！
原創作者：上海遠慕生物科技有限公司
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