技術(shù)文獻(xiàn)
人體細(xì)胞在凋亡的過程中，DNA斷裂并分泌至細(xì)胞外。健康細(xì)胞，胎兒細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞以及移植的細(xì)胞都可以通過這種方式釋放游離DNA至血液中。同時(shí)cfDNA（cell-free DNA） 是腫瘤和產(chǎn)前診斷研究中，被證實(shí)有用的標(biāo)記物。
隨著液體活檢技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)這些的游離核酸檢測(cè)有望成為替代組織活檢的重要方法。大家比較熟悉的游離核酸檢測(cè)手段有定量PCR、NGS等傳統(tǒng)方法和正在迅猛發(fā)展的數(shù)字PCR。
但cfDNA在體液中的含量非常低，通常血清中含量低于10ng/mL。 如何從含量如此低的樣本中，抽提出適合檢測(cè)手段的游離核酸？
液體活檢技術(shù)的興起，使得游離核酸樣本的數(shù)量大增，高通量形式的核酸抽提成為了工作者們的追求，如何低成本解決通量問題？
那就從下方的描述中找到適合您的游離核酸抽提方式吧。
市面上的游離核酸抽提試劑盒大多是基于柱膜法的原理、還有一部分是基于磁珠法的抽提原理。有單管離心、多管真空抽濾、96孔板真空抽濾、磁珠法高通量等形式。*常用的為多管真空抽濾的方式。
多管真空抽濾
采用真空抽濾的方法，在真空抽濾裝置上，可同時(shí)提取24個(gè)1-10mL血清、血漿、尿液等樣本, 結(jié)合&洗滌過程無需使用離心機(jī)。大多客戶用此方法來抽提2-4mL血漿，得到的游離核酸用于后續(xù)的PCR、NGS、甲基化研究。整個(gè)抽提過程需要約45min-3h不等，具體的操作時(shí)間要根據(jù)使用的品牌來定。
NucleoSnap® DNA Plasma 僅需要45min 即可完成EDTA處理的血漿游離核酸的抽提，是目前提取速度較快的游離核酸提取試劑盒。提取到的游離核酸可用于NGS, qPCR, ddPCR等檢測(cè)手段。
應(yīng)用數(shù)據(jù)：
從5mL EDTA血漿中純化cfDNA
NucleoSnap® DNA Plasma kit 和競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手（Competitor Q）比較結(jié)果
從Cell-Free DNA BCT® （Streck）提取cfDNA
3個(gè)不同Cell-free DNA BCT® 保存的樣品，分別使用 NucleoSnap® DNA Plasma （MN） 和a vacuum-processed kit of a competitor （Q）提取cfDNA.使用Bioanalyzer™ 2100 with a High Sensitivity DNA Kit （Agilent）檢測(cè)，分離到的游離核酸在170bp附近有典型的峰（箭頭標(biāo)記）
10mL尿液中分離cfDNA電泳圖
抽提的cfDNA使用 Bioanalyzer™ 2100 with a High Sensitivity DNA Kit （Agilent）分析，在170bp附近有典型的片段分布
單管離心
單管離心抽提游離核酸的方法一般適用于小體積血清或者血漿樣本，通常樣本體積范圍在200uL-2mL。由于樣本上樣量少，游離核酸的得率也較多管真空抽濾的方式要低。此類方法得到的游離核酸一般用來進(jìn)行PCR、qPCR等分子檢測(cè)。
PCR需要的模板量一般是很低的。常規(guī)的20-30uL洗脫體積，一般只用到10%。有沒有一種方法可以讓洗脫體積更小，單位體積里面濃縮更豐富的核酸？
NucleoSpin® Plasma XS應(yīng)運(yùn)而生，采用獨(dú)特的設(shè)計(jì)，柱膜直徑是普通柱膜的一半，僅需要240uL 血漿，5-20uL洗脫液，就可以得到的高濃度核酸，后續(xù)的QPCR檢測(cè)靈敏度也更高。
洗脫體積的大小決定于柱膜直徑!
MN NucleoSpin® Plasma XS：柱膜面積*小，僅5–20 μL洗脫體積就可以得到有效的游離核酸.
Competitor Q （Q）：盡管此試劑盒適用于小樣本量，但是沒有針對(duì)此應(yīng)用做專門的設(shè)計(jì)，洗脫體積至少 20–30 μL.
NucleoSpin® Plasma XS非常適合孕婦血漿中游離核酸檢測(cè)。
應(yīng)用數(shù)據(jù)：
PCR檢測(cè)cfDNA中的RHD和Amelogenin基因NucleoSpin®Plasma XS和MagNA Pure Compact Nucleic Isolation Kit I – Large Volume相比，相同的上樣量 NucleoSpin®表現(xiàn)出更好的性能，分別提前2.6 cycles （RHD gene） 和 2.1 cycles （Amelogenin） 捕獲到PCR信號(hào)。
Data kindly provided by Dr. Doescher, DRK Blutspendedienst NSTOB, Oldenburg, Germany
PCR檢測(cè)cfDNA中k-ras基因NucleoSpin® Plasma XS 和QIAamp DNA Blood Midi相比，NucleoSpin® Plasma XS在低于2.7倍PCR上樣量的同時(shí)，提前2.1cycles捕獲到PCR信息。
Data kindly provided by Dolores C. García-Olmo, PhD, Unidad de Investigación, Complejo Hospitalario Universitario de Albacete, Albacete, Spain
談?wù)摰絾喂茈x心的方式提取游離核酸，還要給大家介紹一款產(chǎn)品Covaris truXTRAC™ cfDNA。
Covaris truXTRAC® cfDNA提取試劑盒配合Covaris自動(dòng)聚焦超聲技術(shù)（Adaptive Focused Acoustics，AFA） ，主動(dòng)解交聯(lián)提取cfDNA，相比傳統(tǒng)方法，cfDNA提取的得率、質(zhì)量和復(fù)雜度都得到顯著提高，更少的血液量即可滿足下游檢測(cè)分析需求。同時(shí)除提取單核小體凋亡cfDNA外，還可獲取血液中少量存在的核小體二聚體、三聚體cfDNA和非凋亡長片段cfDNA，幫助后續(xù)研究獲取更多疾病相關(guān)信息！
truXTRAC® 獲取的cfDNA種類更豐富：
不同cfDNA提取方法獲得cfDNA片段分析
用truXTRAC cfDNA和傳統(tǒng)柱提取法Q試劑盒從相同臨床血液樣本中提取的cfDNA通過Fragment Analyzer（AATI）分析。結(jié)果顯示truXTRAC cfDNA試劑盒配合AFA技術(shù)，無基因組DNA污染，除提取到單核小體凋亡cfDNA外，還獲得了血液中少量存在的核小體二聚體、三聚體cfDNA片段和非凋亡長片段cfDNA，幫助后續(xù)研究獲得更多信息，如檢測(cè)癌癥患者是否存在耐藥性突變等。
truXTRAC® 顯著提高cfDNA得率：
不同cfDNA提取方法得率比較
用truXTRAC cfDNA和傳統(tǒng)柱提取法Q試劑盒從相同10個(gè)臨床血液樣本提取cfDNA。cfDNA得率使用Qbit檢測(cè)，柱狀圖表示得率范圍，X表示10個(gè)供體cfDNA得率的平均值。結(jié)果顯示Covaris truXTRAC cfDNA試劑盒配合AFA技術(shù)，顯著提高cfDNA得率。
96孔板真空抽濾
采用柱膜法原理抽提游離核酸，一次可以抽提96個(gè)樣本，極大的方便了樣本量較多的客戶。
此類產(chǎn)品一般只適用2mL血漿、血清等樣品，提取到的游離核酸可用于NGS, qPCR, ddPCR等檢測(cè)手段。
此類提取方法的代表試劑盒就是NucleoSpin® 96 DNA Plasma。此試劑盒可以在真空抽濾自動(dòng)化核酸抽提平臺(tái)使用，比如：Eppendorf。
NucleoVac 96 Vacuum Manifold
也可以在真空抽濾裝置NucleoVac 96 Vacuum Manifold上使用，此類方法可以極大地節(jié)省購買儀器的費(fèi)用。
應(yīng)用數(shù)據(jù)：
采用96孔板抽濾的方式，從2mL血漿中抽提cfDNA的得率結(jié)果
無論是不同個(gè)體還是不同的采血管均能得到較好的游離核酸抽提結(jié)果
磁珠法高通量
磁珠法是*容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化通量抽提的一種核酸抽提方式，可處理1-10mL血漿樣品，形式也更靈活。提取到的游離核酸可用于NGS, qPCR, ddPCR等檢測(cè)手段。
磁珠法得率的高低主要取決于試劑盒中磁珠的類型。NucleoMag® DNA Plasma采用MN 磁珠- 超順磁性。“超順磁性”代表磁珠可以被磁場(chǎng)吸附，但是自身不會(huì)被磁化，不會(huì)聚集在一起，很容易在溶液中被懸浮；磁珠直徑 1–3 µm，能夠保證沉降時(shí)間，更有利于HTP處理方式，此外小珠有更大的聚集表面積，這也是磁珠擁有結(jié)合能力所必須的。
從不同體積的血漿中分離cfDNA
通過Bioanalyzer™ 2100 系統(tǒng)和PicoGreen™ quantification assay檢測(cè)5組血漿中提取的游離核酸結(jié)果顯示，The NucleoMag® DNA Plasma kit 可以從2-10mL血漿中高效的提取。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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