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技術(shù)文獻(xiàn)

FISH操作中的常見問題及對(duì)策遠(yuǎn)慕新聞√
閱讀次數(shù)：2102 發(fā)布時(shí)間：2019/12/16 10:04:03

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FISH檢測(cè)要求使用中性福爾馬林（不恰當(dāng)?shù)膒H值會(huì)損傷DNA）固定24-48小時(shí)。

固定時(shí)間不足會(huì)導(dǎo)致組織較軟，在預(yù)處理過程中會(huì)丟失部分組織和信號(hào)。

固定時(shí)間過長導(dǎo)致組織變脆，不利于切片，也會(huì)導(dǎo)致大分子交聯(lián)情況嚴(yán)重，很難進(jìn)行消化。

福爾馬林固定石蠟包埋的組織需要用蛋白酶進(jìn)行消化以去除多余的組織來暴露細(xì)胞。

如果消化不足（酶濃度低、溫度不適合、時(shí)間太短），鏡下會(huì)出現(xiàn)云霧狀組織覆蓋在細(xì)胞上，無法觀測(cè)到暴露獨(dú)立的細(xì)胞核，從而降低雜交效率并很難選擇細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，這種情況需要重新制片。

如果消化過度，則細(xì)胞核被損傷，失去正常的圓形完整形狀，變得支離破碎，甚至像鬼影一樣，這種情況只能重新制片。

FISH實(shí)驗(yàn)中可能因?yàn)楦鞣N原因?qū)е赂弑尘?br />
可能原因包括：

1、不適合的探針量

2、不適合的雜交后洗

3、樣本中有過多的重復(fù)序列

解決方法包括：

1、使用合適的探針量

2、改善雜交后洗環(huán)節(jié)：

a、準(zhǔn)備新鮮配制的洗滌液；b、檢查洗滌液的pH、c、檢查水浴缸的溫度（71-73度，一次不超過6片洗滌，每次洗滌后重新升溫）；d、洗滌時(shí)震蕩洗滌缸；e、延長洗滌時(shí)間（*長5分鐘）。

3、使用DNA阻斷劑，如Cot-1 DNA等。

*常見的DNA競(jìng)爭性阻斷劑是COT-1 DNA，它適用于阻斷人基因組中的Alu和L1家族序列，其效能是鮭精DNA的十倍。當(dāng)FISH檢測(cè)出現(xiàn)高背景，且排除預(yù)處理和雜交后洗過程中可能出現(xiàn)的問題時(shí)，實(shí)驗(yàn)者可適當(dāng)加入1μg COT-1 DNA/10 μl 探針，以阻斷可能引起非特異性結(jié)合的重復(fù)性序列，從而減少背景的產(chǎn)生。

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司