技術(shù)文獻(xiàn)
我們做科研的，大多數(shù)人都養(yǎng)過細(xì)胞，細(xì)胞樣本實(shí)驗(yàn)周期短，成本低，我們?cè)陴B(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候不可避免的要用到培養(yǎng)基，比如微生物用到的LB, M9等，動(dòng)物細(xì)胞用到的DMEM等，每種培養(yǎng)基的成分都不盡相同，那么你有沒有考慮過，培養(yǎng)基是如何給細(xì)胞提供營養(yǎng)的呢？那些C源N源到底是怎么維持細(xì)胞生長的呢？我們今天要分享的這篇文獻(xiàn)，就以谷氨酰胺為例，使用同位素追蹤的方法給大家展示在缺氧條件下，谷氨酰胺作為C源是如何維持腫瘤細(xì)胞生長的。
這是19年10月發(fā)表在nature communication上的一篇文章：
文章的研究背景是腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下會(huì)以谷氨酰胺為C源，來研究谷氨酰胺的代謝途徑。
下面我們來解讀一下這篇文章
部分 介紹谷氨酰胺的重要性
當(dāng)然了，先證明谷氨酰胺對(duì)細(xì)胞生長是很重要的，再來研究他的代謝，沒毛病
首先用添加了不同濃度、不同成分的培養(yǎng)基（Glu，AUCG，各種氨基酸）培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中若沒有谷氨酰胺，細(xì)胞死亡率會(huì)顯著上升，而添加了AUCG的培養(yǎng)基可以在谷氨酰胺缺失的情況下抑制細(xì)胞的死亡，說明谷氨酰胺與核苷的合成有關(guān)。由此，作者推論，谷氨酰胺是細(xì)胞生長所必須的物質(zhì)。
那么在缺氧條件下細(xì)胞會(huì)將谷氨酰胺作為C源維持生長，但是谷氨酰胺也是生物體的N源，那么細(xì)胞會(huì)如何處理隨之而來的高濃度的N呢？
在缺氧條件下谷氨酰胺被用來做為主要的C源，尤其是脂質(zhì)合成。
由上圖b可知缺氧條件下細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺（Gln）吸收增加了。通過13C-Gln標(biāo)記發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)前體Ac-CoA增加了（圖c，m+0減少，m+2增加），其他下游物質(zhì)如氨基酸等也增加了（圖d，e）。這些數(shù)據(jù)表明缺氧時(shí)谷氨酰胺作為C源吸收增加了。接下來，作者試圖找到谷氨酰胺的N代謝。谷氨酰胺可以脫去氨基生成NH3，但是對(duì)培養(yǎng)基的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NH3的量沒有升高反而下降了（圖f），NH3可以被代謝成尿素，但是培養(yǎng)基中尿素的含量卻下降了（圖g），因此谷氨酰胺的N應(yīng)該是被其他物質(zhì)利用了。
第二部分 研究谷氨酰胺的代謝
通過在缺氧條件下的含N代謝物的篩選，得到了6個(gè)顯著升高的物質(zhì)，11個(gè)顯著下降的物質(zhì)。其中，五個(gè)顯著上調(diào)的物質(zhì)：IMP、DOHA、OA、鳥嘌呤和肌苷參與了nucleotide biosynthesis通路，驗(yàn)證結(jié)果也表明在HeLa、MCF-7和4T1細(xì)胞中IMP（AMP和GMP的前體）、carbamoyl-Asp、DHOA、OA都顯著升高。這些結(jié)果表明缺氧導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核苷酸的前提累積，尤其是嘧啶前體，包括carbamoyl-Asp、DHOA和OA。
· 缺氧條件下谷氨酰胺的N富集在DOHA和OA上
作者使用N15標(biāo)記的谷氨酰胺來追蹤N的吸收。由上圖可知，酰胺基（Amine）上的N會(huì)轉(zhuǎn)移到Asp、DOHA、OA、UMP、IMP上，而氨基（Amide）上的N會(huì)轉(zhuǎn)移到DHOA、OA、UMP、IMP上。
在缺氧條件下，標(biāo)記的DHOA和OA含量顯著上升，說明谷氨酰胺的N富集于DHOA和OA上，但是DHOA和OA的代謝效率不高，因?yàn)橄掠萎a(chǎn)物UMP含量沒有增加。
標(biāo)記的N還可以在氨基酸中檢測(cè)到，但是在缺氧條件下，被標(biāo)記的氨基酸含量都沒有升高，因此這些數(shù)據(jù)可以證明缺氧條件下谷氨酰胺的N富集于DHOA和OA上而不是氨基酸上。
· 缺氧條件下促使天冬氨酸作為嘧啶前體
由上圖可知，谷氨酰胺的C在通過TCA循環(huán)和α-酮戊二酸羧化還原途徑轉(zhuǎn)移到天冬氨酸之后可以被合成為嘧啶。這兩條途徑可以通過檢測(cè)C13-Gln來源的乙酰輔酶A，天冬氨酸，檸檬酸，DHOA和OA來區(qū)分。正常條件下，谷氨酰胺的C進(jìn)入TCA循環(huán)，可以生成M+4的Asp，檸檬酸，DHOA和OA；在缺氧條件下，生成m+2的乙酰輔酶A，m+3的天冬氨酸，m+5的檸檬酸，m+3的DHOA和OA通過還原途徑生成；m+3的UMP可以由兩條途徑都生成。
由上圖結(jié)果可知缺氧條件下谷氨酰胺的C通過還原途徑進(jìn)入了乙酰輔酶A、DHOA和OA，并且含量有所升高，因此缺氧條件促進(jìn)了他們的合成。但DHOA的直接前體：天冬氨酸含量卻降低了，這可能與嘧啶合成通路中多個(gè)酶參與有關(guān)，為研究這個(gè)現(xiàn)象，作者使用C13,15N-Asp來追蹤天冬氨酸在嘧啶合成中的代謝。
由上圖可知，檢測(cè)到了m+5的Asp表明細(xì)胞完全可以吸收外源的13C-15N-Asp（圖a），也檢測(cè)到了15N-m+1的谷氨酸和天冬氨酸，13C-m+4的天冬氨酸（圖a，b）；缺氧使細(xì)胞吸收更多的天冬氨酸，有趣的是，正常條件下細(xì)胞并不能產(chǎn)生很多的DHOA和OA, 但是在缺氧條件下DHOA和OA的含量都升高了（m+4，m+5顯著升高），而且m+4的天冬氨酸生成m+5的DHOA和OA效率更高了，因此缺氧使天冬氨酸到DHOA和OA的途徑活性升高了，這也導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的天冬氨酸含量降低。
· DHOA和OA是細(xì)胞生長必須的嗎？
從上述結(jié)果來看，缺氧條件下大部分的谷氨酰胺都生成了DHOA和OA，那么他們對(duì)細(xì)胞生存是必須的嗎？作者對(duì)DHOA和OA通路上的酶做了knockdown，如CAD、DHODH、GOT1。
DHODH和CAD是嘧啶合成的關(guān)鍵酶，因此他們的knockdown即使在正常條件下也明顯的影響了細(xì)胞的分化。相反的是，缺氧條件下，GOT1的敲除輕微地影響了細(xì)胞的分化。而CAD和GOT1的敲除讓細(xì)胞無法生長，DHODH的敲除只是稍微影響細(xì)胞的生長。這說明對(duì)于細(xì)胞來說，DHOA才是不可缺少的，而不是OA。
CAD和GOT1的敲除顯著降低了DHOA和OA的含量（圖e，f），同時(shí)也減少了α-酮戊二酸，檸檬酸和乙酰輔酶A的含量（圖g）。雖然天冬氨酸可以合成DHOA和OA，外源添加天冬氨酸也并沒有使DHOA和OA的量增加（圖e，f）。這些數(shù)據(jù)說明谷氨酰胺的C代謝和N代謝都與DHOA有關(guān)。
為了確認(rèn)這個(gè)假設(shè)，使用α-酮戊二酸（C來自谷氨酰胺）處理細(xì)胞，結(jié)果顯示α-酮戊二酸的添加可以減少谷氨酰胺的吸收（圖d），幾乎完全清除了DHOA和OA的積累（圖h，i），并且抑制了DHOA的分泌（圖j）。尿苷和α-酮戊二酸的添加可以使敲除酶的細(xì)胞增值增加，但是單獨(dú)添加尿苷不能，單獨(dú)添加α-酮戊二酸或添加α-酮戊二酸和尿苷可以升高細(xì)胞的增殖，這些結(jié)果表明谷氨酰胺的C代謝對(duì)細(xì)胞生長來說是必要的，并且取決于DHOA的合成。
總結(jié)一下
通過同位素追蹤，文章展示了一條在缺氧條件下的谷氨酰胺通路，找到了缺氧條件下腫瘤細(xì)胞中的代謝變化，找到了谷氨酰胺的代謝產(chǎn)物DHOA和OA, 并在病人和小鼠中也檢測(cè)到了升高的DHOA和OA，因此他們可以作為腫瘤的潛在標(biāo)志物，通路上的酶如CAD和GOT1可以作為腫瘤治療的可能目標(biāo)。
怎么樣，代謝流的結(jié)果是不是很強(qiáng)大呢？
它可以為我們提供更直接的證據(jù)來說明問題，在基因工程和不同環(huán)境或不同代謝途徑中找到關(guān)鍵通路及代謝功能變化方面提供強(qiáng)有力的證據(jù)。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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