技術(shù)文獻(xiàn)
我們研究mRNA功能時(shí)，*常規(guī)的操作就是使用實(shí)時(shí)定量PCR分析功能基因的表達(dá)。研究人員僅需下載GenBank中目的基因的參照mRNA序列，設(shè)計(jì)、合成一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物和一對(duì)適宜的看家基因擴(kuò)增引物，抽提檢測(cè)樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，通過(guò)比較試驗(yàn)組和對(duì)照組的基因表達(dá)情況，就能確定試驗(yàn)處理能否影響功能基因的表達(dá)�？此品浅：�(jiǎn)便的操作真的能達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康膯�？答案是，你可能真的做錯(cuò)了！��！下面就讓遠(yuǎn)慕生物的小編來(lái)給各位解答吧！
研究mRNA功能時(shí)，科研人員可能忽略了一個(gè)重要的試驗(yàn)環(huán)節(jié)——RACE。
cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一種基于PCR從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA的5＇和3＇末端的有效方法。實(shí)時(shí)定量PCR之前的RACE試驗(yàn)主要是為了①確定實(shí)驗(yàn)樣本里的功能基因全長(zhǎng)序列；②更為關(guān)鍵的，確定目的基因是否存在可變剪接（也稱為選擇性剪接，alternative splicing），可變剪接的數(shù)量及相應(yīng)序列。
大量的功能基因通過(guò)可變剪接編碼不同的蛋白，同一基因的不同可變剪切甚至可以執(zhí)行不同，甚至是完全相反的功能。
以上圖為例，該基因如果存在E1~E4 4個(gè)外顯子，在檢測(cè)樣品中該基因存在外顯子跳躍所導(dǎo)致的可變剪接現(xiàn)象，對(duì)應(yīng)序列分別為完整的蛋白，E4、E3和E2缺失的不同氨基酸編碼產(chǎn)物。當(dāng)基因特異性定量的引物設(shè)計(jì)區(qū)域位于區(qū)域1和3時(shí)，定量檢測(cè)結(jié)果顯示的是該基因4種可變剪接的總表達(dá)情況，不能分析不同可變剪接的各自的表達(dá)；當(dāng)引物設(shè)計(jì)區(qū)域位于區(qū)域2 時(shí)，所設(shè)計(jì)的上、下游引物位于哪個(gè)外顯子或是哪些外顯子，將直接影響實(shí)時(shí)定量PCR的試驗(yàn)結(jié)果，并與區(qū)域1 和區(qū)域3的檢測(cè)結(jié)果存在差異。
在實(shí)時(shí)定量PCR前，只有通過(guò)RACE技術(shù)獲得目的序列的可變剪接序列信息，即是否存在可變剪接，并針對(duì)不同可變剪切體的差異區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)引物，才能獲得相應(yīng)的可變剪接體的表達(dá)情況，確定試驗(yàn)處理對(duì)基因表達(dá)的影響。
那么，我們?cè)撊绾芜x擇RACE試劑盒呢?
我們推薦遠(yuǎn)慕生物RACE cDNA合成試劑盒。該試劑盒使用了*經(jīng)典的SMART技術(shù)，并做了如下優(yōu)化：
1. 將5?端跳轉(zhuǎn)接頭的合成方式從RNA轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA。不僅降低了試劑盒運(yùn)輸和儲(chǔ)存的難度，也使得試驗(yàn)體系更為穩(wěn)定。
2. 兩端接頭引物從單一序列變?yōu)椴煌蛄�。避免因接頭引物單引物自擴(kuò)增，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)。
3. 引物體系按物種分為植物、動(dòng)物和帶poly A尾的病毒3種不同的試劑盒。
4. 通過(guò)調(diào)整轉(zhuǎn)錄Buffer，使得反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性由末端加1~3個(gè)C，優(yōu)化成末端加6~7個(gè)C，5?跳轉(zhuǎn)效率更為高效，更容易獲得5?端全長(zhǎng)。
遠(yuǎn)慕生物的RACE cDNA合成試劑盒表現(xiàn)優(yōu)異，能夠?qū)崿F(xiàn)高效和穩(wěn)定基因全長(zhǎng)克隆結(jié)果，使研究人員更容易獲得功能基因的可變剪接。
讓我們選擇正確的功能基因研究操作，讓我們選擇遠(yuǎn)慕生物RACE cDNA合成試劑盒。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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