技術(shù)文獻(xiàn)
| 問題 | 序號 | 可能原因 | 解決方法 |
| 顯色淡，靈敏度偏低 | 1 | 試劑盒未充分平衡 | 試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃） |
| 2 | 樣品不適合做ELISA檢測 | 樣品一般選擇培養(yǎng)上清、血清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測或者需要優(yōu)化檢測的條件（例如稀釋液的成分） | |
| 3 | 酶標(biāo)板在貯存或洗后拍干時過分干燥 | 防止板過于干燥 | |
| 4 | 包被抗體遭到破壞 | 操作溫和，移液槍不能碰到孔底 | |
| 5 | 樣本和抗體孵育條件不合適 | 按照說明書條件，建議孵育過程中全程振蕩孵育。 | |
| 6 | 洗滌浸泡時間過長 | 按照說明書操作。勿人為增加浸泡時間； | |
| 7 | 偶聯(lián)HRP試劑污染 | 棄去試劑，重新配置 | |
| 8 | 錯誤的稀釋偶聯(lián)HRP試劑 | 棄去試劑，重新配置 | |
| 9 | TMB底物孵育時間過短，因非人為因素影響，需要優(yōu)化孵育時間 | 確定合適的孵育時間：人為判定-濃度的標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)深藍(lán)色；S4-5有淡藍(lán)色；機(jī)器判定620 nm波長下測定OD值達(dá)到0.6-0.65 | |
| 10 | 樣本濃度過高或存在基質(zhì)效應(yīng) | 建議做不同稀釋倍數(shù)，確認(rèn)樣本*佳稀釋倍數(shù)。 | |
| 11 | 酶標(biāo)儀濾光片設(shè)置有問題或者波長選擇不對 | 確認(rèn)儀器設(shè)置及選擇正確的波長檢測。 | |
| 12 | 酶標(biāo)板不適合做ELISA | 不能使用細(xì)胞培養(yǎng)板，建議使用ELISA專用高吸附力板子。 | |
| 背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD<0.2） | 1 | 洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標(biāo)記物殘留 | 洗液準(zhǔn)確配制；充分洗滌，靜置15秒，徹底拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染。 |
| 2 | 底物污染，未避光保存，出現(xiàn)顏色 | 棄去底物，重新配置 | |
| 3 | 樣品稀釋液污染 | 棄去稀釋液，重新配置 | |
| 4 | 吸頭重復(fù)使用，未洗凈或消毒不徹底 | 吸頭盡可能一次性使用 | |
| 5 | 不正確的孵育時間，溫度（尤其是底物孵育的時間） | *為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。完全按照說明書要求。 | |
| 6 | 偶聯(lián)抗體（streptavidin-HRP）濃度過高 | 按照說明書調(diào)整到*佳的濃度 | |
| 7 | ELISA板子不正確的貯存 | 酶標(biāo)板貯存于2-8 ℃；使用結(jié)合力低點的Elisa板 | |
| 8 | 沒有正確封閉 | 在標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中加入動物蛋白或延長封閉時間 | |
| 9 | 樣本溶血嚴(yán)重 | 建議使用非溶血或輕微溶血樣本，嚴(yán)重溶血樣本會導(dǎo)致背景偏高。 | |
| 重復(fù)性不佳，高CV值 | 1 | 樣品不均一 | 加樣前充分混勻樣品，取樣確保移液位置一致； |
| 2 | 包被板表面遭到破壞 | 洗板加樣時盡量小心，避免破壞板的包被表面 | |
| 3 | 孔與孔之間的交叉污染 | 孵育后取下蓋子小心操作，避免孔與孔的污染；封板膜不能重復(fù)使用 | |
| 4 | 加樣量不一致 | 樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴 | |
| 5 | 邊緣效應(yīng)（外周孔顯色較中心孔深） | 孵育時盡量100 rpm旋轉(zhuǎn)混勻 | |
| 6 | 微量加樣不準(zhǔn)確 | 保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性 | |
| 7 | 不正確的洗滌 | 洗液準(zhǔn)確配制；充分洗滌，靜置15秒，確定每一步的洗滌 | |
| 出現(xiàn)白板，陽性對照不顯色 | 1 | 顯色液變質(zhì) | 更換新的顯色液 |
| 2 | 洗滌液配制有誤 | 請按說明書所示稀釋倍數(shù)配制 | |
| 3 | 未加酶結(jié)合物而認(rèn)為已加入 | 注意不要漏加 | |
| 4 | 終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜镆菏褂?/span> | 每次加液前均應(yīng)看清標(biāo)簽 | |
| 5 | 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法錯誤/或標(biāo)準(zhǔn)品有問題 | 請按照說明書所示配置說明書，注意單位和稀釋倍數(shù) | |
| 6 | 不同試劑盒或不同批號的試劑混用 | 建議使用同批次試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。 | |
| 不正常的標(biāo)準(zhǔn)曲線 | 1 | 錯誤的方法重懸標(biāo)準(zhǔn)品 | 加入正確量的溶液重懸標(biāo)準(zhǔn)品，重懸充分 |
| 2 | 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯誤 | 按照說明書要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品 | |
| 3 | 標(biāo)準(zhǔn)品污染 | 使用一次性的滅菌吸頭， 標(biāo)準(zhǔn)品貯存于2-8 ℃ | |
| 4 | 錯誤的倍比稀釋步驟 | 按照說明書倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品 | |
| 5 | 波長選擇錯誤 | TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而 前者比色波長為450nm，后者為492nm。雙波長比色分析優(yōu)于單波長。 | |
| 6 | 標(biāo)準(zhǔn)品混用 | 不同批號試劑勿混用 | |
| 7 | 試劑盒在運(yùn)輸途中時間太長，溫度太高，標(biāo)準(zhǔn)品失活 | 盡量縮短運(yùn)輸時間，夏季應(yīng)放冰塊降溫 | |
| 8 | ELISA未終止而直接檢測450nm和620nm | TMB顯色需終止后檢測，否則會出現(xiàn)620nm比450nm讀數(shù)高的現(xiàn)象。（數(shù)值仍有梯度規(guī)律） | |
| 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品OD超出正常范圍 | 1 | 錯誤的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋 | 完全按照說明書稀釋 |
| 2 | 偶聯(lián)抗體濃度過高 | 按照說明書調(diào)整到*佳的濃度 | |
| 3 | TMB底物孵育時間過長 | 調(diào)整到合適的孵育時間 | |
| 4 | 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品污染 | 避免污染 | |
| 5 | 錯誤的孵育時間或溫度 | 完全按照說明書 | |
| 6 | 孵育時未加蓋導(dǎo)致溶液揮發(fā)和污染 | 貼封片或加蓋 | |
| 標(biāo)曲很好，但是樣本無法計算到數(shù)值 | 1 | 標(biāo)曲選擇不合適 | 選擇*合適的標(biāo)曲擬合； |
| 2 | 樣本含量很低，低于靈敏度無法被檢測到 | 嘗試濃縮樣本或使用高敏elisa試劑盒檢測 | |
| 3 | 樣本含量很高，超過標(biāo)曲 | 建議進(jìn)行預(yù)實驗摸索稀釋倍數(shù)，確保樣本OD值落在標(biāo)曲范圍內(nèi) | |
| 標(biāo)曲高濃度間無明顯趨勢 | 1 | 如OD絕對值靠譜，但是僅無梯度，則顯色過度 | TMB顯色體系中建議根據(jù)S1，S2顏色進(jìn)行判斷，當(dāng)S1，S2深藍(lán)色，有明顯梯度，S5有淡藍(lán)色時即可終止。 |
| 2 | 僅作單波長檢測。 | 由于參考波長讀取非特異性檢測，如指紋、劃痕、水漬等，對結(jié)果也有影響。建議*終結(jié)果以雙波長為*準(zhǔn)確。 |
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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