胞嘧啶堿基編輯器（CBE）由胞嘧啶脫氨酶和nCas9
蛋白融合組成。其中，經(jīng)典的胞嘧啶堿基編輯器BE4max CBE是由鼠源脫氨酶APOBEC1、nCas9蛋白和兩個(gè)尿嘧啶糖基化酶抑制劑構(gòu)成。該項(xiàng)研究基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)改造了一類人源脫氨酶A3G, 并用其替代BE4max CBE中的鼠源脫氨酶，使A3G-CBE能夠-程度地只編輯靶向堿基C而不影響與其緊鄰無關(guān)的C。
單堿基編輯面臨精度挑戰(zhàn)
與傳統(tǒng)基因編輯策略相比，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的DNA單堿基編輯技術(shù)不會(huì)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂, 因此避免了由易錯(cuò)DNA修復(fù)通路所引入的隨機(jī)序列插入和刪除（Indels），從而極大地提高了編輯效率和產(chǎn)物純度，為基因編輯應(yīng)用在遺傳疾病的基礎(chǔ)研究和治療帶來了曙光。
胞嘧啶堿基編輯器能夠在靶基因座上高效地進(jìn)行胞嘧啶到胸腺嘧啶（C-to-T）的轉(zhuǎn)換，并已經(jīng)被用于相關(guān)疾病動(dòng)物模型治療研究，例如糾正由地中海貧血癥。
“但是，單堿基編輯仍然面臨精度挑戰(zhàn)。”舉例說，當(dāng)靶向堿基C緊鄰的堿基也是C時(shí), 目前的CBE堿基編輯器很難區(qū)分它們。因?yàn)閮蓚�(gè)相鄰的堿基C往往都會(huì)被編輯，從而無法達(dá)到精準(zhǔn)糾正相關(guān)疾病的目的。這為使用CBE編輯器研究和治療此類遺傳疾病帶來了很大困難。
改造脫氨酶
之前研究表明，野生型的人源脫氨酶A3G主要對(duì)DNA單鏈5′-CCC-3′基因組序列中的第三個(gè)C產(chǎn)生脫氨基作用，即由C編輯為T。因此，這種選擇性有很大潛力被用于連續(xù)C區(qū)域的精確堿基編輯。
他們首先通過密碼子優(yōu)化，將野生型的A3G用于替換BE4 max中的鼠源脫氨酶rAPOBEC1，構(gòu)建出A3G-BE 2.1。
因?yàn)锳3G 的N-端結(jié)構(gòu)域會(huì)導(dǎo)致A3G單體的聚集，并阻止A3G的脫氨活性；而A3G的C端結(jié)構(gòu)域本身足以脫氨。為了提高編輯效率，他們進(jìn)一步構(gòu)建了只保留C端結(jié)構(gòu)域的A3G-BE 4.4。
在
細(xì)胞中的測(cè)試結(jié)果顯示，A3G-BE 2.1和A3G-BE 4.4均可有效地區(qū)分連續(xù)C區(qū)域中的靶向C和無關(guān)C，而BE4 max則無選擇性地將兩個(gè)連續(xù)的C全部編輯。
為了進(jìn)一步提高A3G-BE的編輯效率，他們通過分析A3G的C端結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸，設(shè)計(jì)了三組突變，分別用于加強(qiáng)脫氨催化活性，增加ssDNA結(jié)合親和性，提高蛋白質(zhì)溶解度。
而為了保留A3G的高選擇性，研究者同時(shí)又引入Y315F來提升非特異性DNA結(jié)合，從而*終優(yōu)化得到了A3G-BE 5.13和A3G-BE 5.14。其中，A3G-BE5.13的堿基編輯活性稍高，A3G-BE5.14的選擇性稍高。“兩種新CBE可以在不同情形的多C編輯中互補(bǔ)。
準(zhǔn)確性安全性俱佳
為了驗(yàn)證改造后的A3G-BE，他們將A3G-BE 4.4、A3G-BE 5.13和A3G-BE 5.14用于在細(xì)胞系中構(gòu)建疾病模型和校正單堿基突變疾病，并與BE4max相比較。
結(jié)果顯示，改造后三種A3G-CBE能夠選擇性地對(duì)5′-CC-3′序列中第二個(gè)C而非個(gè)C進(jìn)行編輯，明顯區(qū)分了靶向C和無關(guān)C，并生成了高占比的目標(biāo)基因型，而BE4max則無法產(chǎn)生理想的靶向C編輯結(jié)果。
值得注意的是，A3G-BE5.14在生成轉(zhuǎn)甲狀腺素模型淀粉樣變的疾病模型的效率比BE4max 高613倍，更突出了其精確性的優(yōu)勢(shì)。
而在疾病模型的測(cè)試中，A3G-BE4.4以大于50%的靶向C編輯效率高效校正了導(dǎo)致全羧化酶合成酶缺乏癥的單堿基突變，并且沒有對(duì)鄰近無關(guān)的C產(chǎn)生編輯。其產(chǎn)生理想校正基因型的能力比BE4max高6496倍。
“與BE4max CBE相比，A3G-CBE在糾正相關(guān)單堿基突變疾病的能力提高得非常顯著。”
為了研究A3G-CBE的安全性，他們還通過RNA測(cè)序和全基因組測(cè)序進(jìn)行脫靶編輯的表征。結(jié)果顯示，靶向編輯活性較高的A3G-BE 5.13與對(duì)照nCas9的脫靶水平相當(dāng)，沒有顯著脫靶效應(yīng)。
這些結(jié)果進(jìn)一步證明，A3G-CBEs具有很高的應(yīng)用價(jià)值，有很大希望被用于單堿基突變遺傳疾病的體內(nèi)治療研究。這項(xiàng)研究進(jìn)一步加快了精準(zhǔn)堿基編輯邁向臨床應(yīng)用的步伐。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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