技術(shù)文獻
一般來說，細胞進行轉(zhuǎn)移和保存，*佳的策略是進行低溫保存（-70℃~-196℃），而細胞深低溫保存的基本原理是：在-70℃以下時，細胞內(nèi)的酶活性均已停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故而可以長期保存。細胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程，在此溫度范圍內(nèi)，冰晶呈針狀，極易招致細胞的嚴(yán)重損傷。
經(jīng)過前人的長期試驗，發(fā)現(xiàn)細胞的凍存及復(fù)蘇基本原則是 慢凍速融，這樣可以限度的保存細胞活力。 目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。
復(fù)蘇細胞應(yīng)采用 快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。
No.1 材料準(zhǔn)備
1. 儀器：凈化工作臺、 離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。
2. 玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、 培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。
3. 塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。
4. 其他物品：微量加樣槍、紅血球計數(shù)板、記號筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍。
5. 試劑：D-Hanks液、胎牛血清、培養(yǎng)液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油。
No.2 細胞凍存
1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌種保存很少用于細胞凍存。
2、取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中。
3、離心1000 rpm,5 min。
4、去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的*終密度為5x10^6/ml~1x10^7/ml。
5、 在凍存管上標(biāo)明細胞的名稱，凍存時間及操作者。
6、凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/min；當(dāng)溫度達到-25℃以下時，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。
No.3 細胞復(fù)蘇
1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。
2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。
3. 離心， 1000 rpm，5 min。
4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融
當(dāng)細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。
如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。
慢凍程序
1. 標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細胞凍存器
當(dāng)溫度在-25 ℃以上時， 1~2 ℃/min；
當(dāng)溫度達-25 ℃以下時， 5~10 ℃/min；
當(dāng)溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中。
2. 簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜，次晨投人液氮中。
3. 傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽長期儲存。
No.4 細胞計數(shù)及存活測試
1、原理：
(1)計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。
(2)血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10 -4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。
(3)存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計算細胞活率：活細胞數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100%。計數(shù)應(yīng)在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時間延長，部分活細胞也開始攝取染料;因為臺盼蘭對蛋白質(zhì)有很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數(shù)更為準(zhǔn)確。
2、材料：
0.4%w/v trypan blue；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish、0.05gram preservative methyl paraben溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計數(shù)器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細胞稀釋液(4%乙酸溶液)。
3、步驟：
(1)取50μl細胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
(2)取少許混合液(約15μl)自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosin bluish)。
(3)計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，*后乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
注：
4大格細胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×10 4/4=細胞數(shù)/ml 每一大格的體積=2.5px×2.5px×0.25px=10 -4ml
計數(shù)板計數(shù)時，*適濃度為5～10×10 5細胞/ml，此范圍外計數(shù)誤差偏大。高濃度細胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計數(shù)。
注意要點：
1、冷凍越慢越好，復(fù)蘇越快越好。
2、與液氮接觸的操作，注意戴保護眼鏡和手套。細胞復(fù)蘇時，水浴中搖動小瓶易爆炸。且DMSO為有毒致癌品，接觸時帶好手套。
3、凍存細胞數(shù)量要足夠，一般要達到5x10^6/ml。濃度視情況而定。
4、做好標(biāo)記：培養(yǎng)瓶上應(yīng)該用馬克筆做好標(biāo)記，寫上細胞名稱、代數(shù)和凍存時間。
5、對剛復(fù)蘇的細胞動作要輕柔，避免細胞破裂。
6、DMSO對大多數(shù)細胞不敏感，所以解凍之后不需要除去DMSO，解凍后頻繁換液會慢慢除去DMSO。部分對DMSO敏感的細胞需要除去DMSO。
7、解凍后的細胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清，突然換不一樣的培養(yǎng)液和血清會造成細胞生長不良，甚至死亡。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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