、反復(fù)凍融法：
1. 將
細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。
2. 至少3次以上凍溶。
3. IFCC推薦法：
收集細(xì)胞懸液，4℃低溫離心（3000rpm，5min），棄上清，加入定量PBS（200ul），輕輕吹打混勻，-200C 冷凍30 min，370C 解凍，如此反復(fù)3次，可形成細(xì)胞裂解液。
4. 用液氮凍融三四次就可以了，細(xì)胞凍住后，取出放37度水浴，溶解后震蕩，再凍
二、超聲波處理法
1. 要設(shè)定好超聲時(shí)間和間隙時(shí)間，般超聲時(shí)間不超過(guò)5，間隙時(shí)間-好大于超聲時(shí)間，這些都有利于保護(hù)酶的活性。我的實(shí)驗(yàn)超聲時(shí)間5、間隙時(shí)間10、工作次數(shù)20次。
2. 每個(gè)樣本超聲時(shí)間5,每個(gè)間隔5,粉碎5次。
3. 100ml菌液離心，用8ml緩沖液懸浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超聲處理。750W 40％功率。5超聲，9間隔。超聲至少90min。
4. 綜合凍融和超聲的方法：
1500g離心，棄除上清。冰上，用小體積PBS重懸細(xì)胞。
將重懸液集中，1500g離心濃縮，棄除上清。液氮驟冷。用約5倍體積的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，并攪拌。
可選擇：4℃下超聲破碎細(xì)胞。加入終濃度為0.25M的KCl，15mM的DTT。4℃下111500g×60min離心裂解液。取出上清。過(guò)柱子。
Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol
三、滲透法：
冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA處理，冰浴放置10min。
四、裂解液處理法：
1. 細(xì)胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚藍(lán)，10%甘油。SDS是陰離子型表面活性劑、易促溶、強(qiáng)變性作用。
2. 在loading buffer加SDS，100度5分鐘，是變性方法。SDS與
蛋白等量結(jié)合，可以通過(guò)條帶位移判斷蛋白大小，考染不會(huì)影響結(jié)果。
3. 如果是做小量菌液，跑PAGE膠看其表達(dá)情況的話，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分鐘即可，需注意的是上樣要離心12000rpm至少5分鐘，然后上樣時(shí)，槍頭別吸底下的。
4. 20毫升細(xì)胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸餾水。
5. 我始終未明白樓主如果想收集全蛋白，而不考慮包涵體的話，為何要用超聲呢？直接水煮不就可以了嗎？
6. 將1ml菌離心棄上清，留大概50ul，再加50ul 2×上樣緩沖液，煮10min，取20ul上樣，就可以了。
7. 檢測(cè)蛋白誘導(dǎo)：
從培養(yǎng)的不同時(shí)期各取出1ml，12000g×1min離心。將沉淀重懸于100ul 1×SDS上樣緩沖液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚藍(lán)，10％甘油）中，100℃加熱3min，然后12000g×1min離心。上樣15ul，6％SDS-PAGE電泳。
8. 5-10離心，棄除上清，用50ul蒸餾水重懸沉淀。加入1ul PMSF，再加入50ul熱的2×SDS上樣緩沖液（100℃加熱）。迅速混勻后100℃加熱3-5min。將樣品冰上放置（或-20℃放置），然后再溶解，煮沸1min。離心30。上樣5ul進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
2×SDS上樣緩沖液：250mM Tris-Cl，6.2％（w/v）DTT，8％SDS，0.002％（w/v）溴酚藍(lán)，40％甘油。
Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。
9. 裂解液：50mMTris-HCl(pH8.5~9.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-100，1mg/ml溶菌酶。
10. 我們用NP40（NP40：NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇，是種非離子表面活性劑。）加DTT和蛋白酶抑制劑裂解細(xì)胞，冰上放30－60min，然后13000rpm離心15min，取上清定量。
11. 裂解液配方是：50mmol/L Tirs-HCI (PH 8.0)，150mmol/L NaCI，0. 02% 疊氮鈉，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，1% Triton X-100 ( or NP-40)。
12. 對(duì)于組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞，-有效的裂解方法是用去污劑（表面活性劑）進(jìn)行處理，溶解細(xì)胞膜并溶解蛋白質(zhì)。50mmol/L Tirs-HCl(PH 8.0)、150mmol/L NaCl、0. 02% 疊氮鈉、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ( or NP-40) ，這種裂解液可能是-常用的裂解緩沖液。
13. 細(xì)胞裂解液的主要目的：
（1）利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細(xì)胞；
（2）溶解蛋白；
（3）蛋白變性使其穩(wěn)定；
（4）抑制蛋白酶活性。
推薦RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4（緩沖體系），150 mM NaCl（等滲體系），1 mM PMSF （強(qiáng)大的蛋白酶抑制劑），1 mM EDTA（變性劑和穩(wěn)定劑），5 μg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制劑），5 μg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制劑），1% Triton x-100（破壞細(xì)胞），1% Sodium deoxycholate（中度變性劑和蛋白溶解劑），0.1% SDS（強(qiáng)變性劑和蛋白溶解劑）。
14. 裂解buffer：50mM HEPES pH7.0，1mM 甘油，1mM DTT（還原劑），7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解），1mM EDTA(金屬鏊合劑），1mM PMSF，1mg/ml leupeptin，1mg/ml aprotinin，1mg/ml pepstatin(蛋白酶抑制劑），50mM NaF(ph7.0)（anti hemoaggulating），1mM Na3VO4(ph7.0)（inhibitor of phosphatases），2mM benzamidine（inhibitor of trypsin）。
15. 可選擇：取0.5ml誘導(dǎo)的細(xì)胞并離心2min。棄除上清，用100ul 1×SDS上樣緩沖液重懸，冰上放置。
6000rpm×10min離心培養(yǎng)物。棄除上清，用10ml預(yù)冷的裂解液重懸沉淀。液氮驟冷細(xì)胞或-20℃冷凍細(xì)胞。在冷水中溶解細(xì)胞。15、4次超聲處理細(xì)胞。冰浴降溫。4℃，9000g×30min離心。取上清。
裂解液：5 mM DTT，15 mM KCl，5 mM MgCl2，50 mM HEPES, pH 7.9，1 mM EDTA，10 mg/ml溶菌酶（臨用加上DTT和溶菌酶）。
Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Basic Protocol
16. 收集細(xì)胞。在液氮中突然冷凍細(xì)胞。用含有蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液懸浮沉淀。用100 μg/ml溶菌酶處理并在冰上孵育15 min。加上10% N-laurylsarcosine (終濃度1.5%)，然后超聲波破碎。16000 rpm×30 min離心。取上清然后加入Triton X-100至終濃度為2.0%。過(guò)Ni-NTA–瓊脂糖柱層析。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
客服一
