檢測限和定量限是分析方法的重要屬性，在中國藥典2020年版分析方法驗證指導(dǎo)原則中規(guī)定這2項是重要的驗證指標，包括定量、限度的雜質(zhì)測定需要著重考慮檢測限和定量限，且在該版本指導(dǎo)原則中刪除了校正因子以及其中定量限的規(guī)定。本文試圖從定義、測量方法、常見問題和解決方案進行簡單的討論，為分析方法驗證活動中檢測限和定量限的的開展提供定的參考。
1、檢測限和定量限的定義
檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的低量，定量限系指試樣中被測物能被定量測定的低量。檢測限僅作為限度試驗指標和定性鑒別的依據(jù)，沒有定量意義。而對微量或痕量藥物分析、定量測定藥物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物時，應(yīng)確定方法的定量限，需要注意的是定量限的測定結(jié)果應(yīng)符合準確度和精-密度要求。
2、檢測限和定量限的測量方法
檢測限和定量限常用的測量方法有直觀法、信噪比法、基于響應(yīng)值標準偏差和標準曲線斜率法等3種方法，不同方法應(yīng)用范圍有所不同：
（1）直觀法主要用于非
儀器方法，通過目視法觀察逐稀釋進樣獲得非儀器方法檢出限（或定量測定）的低濃度或量。
（2）信噪比法適用于能顯示基線噪音的儀器分析方法，是通過已知低濃度的被測物的檢測信號與基線噪音比較，確定可被檢測出的小量或濃度。檢測限般以信噪比為3:1或2:1；定量限般以信噪比為10:1。
（3）基于響應(yīng)值標準偏差和標準曲線斜率法可采用已知標準物質(zhì)與空白樣品，或已知含量的樣品在低濃度范圍按照分析步驟進行測量，通過分析相當數(shù)量的樣品（需要12~20份）計算方法的檢出限和定量測定低濃度或量，其計算公式為（公式1）：
LOD（LOQ）=3.3（或10）δ/S
式中：LOD（LOQ）：檢測限（定量限）；δ：響應(yīng)值的偏差；S：標準曲線的斜率。δ可以通過下列方法測得：（1）測定空白值的標準偏差；（2）標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差來代替。
3、檢測限和定量限的常見問題
由于使用上的方便性，信噪比法是目方法驗證中常用的測量方法。但信噪比受檢測儀器狀態(tài)的影響很大，且與耗材、試劑、樣品處理等多種因素相關(guān)，按信噪比3/10計算與驗證過的檢測限/定量限在下次檢測時并不是方法的檢測限/定量限，因此導(dǎo)致方法驗證出現(xiàn)異常，測量的定量限（檢測限）并不是真正的方法定量限，特別是定量限可能不能滿足精密度和準確度要求，即定量限測不準原理。
信噪比法測量檢測限和定量限的主要問題在于其本質(zhì)上也是種直觀測量的方法，主要用于儀器檢出限的測量和判斷。而儀器檢出限（對于復(fù)雜的系統(tǒng)更應(yīng)該稱為系統(tǒng)檢出限）則受到由整個檢測系統(tǒng)性能的影響（如高效液相法由HPLC儀器、色譜柱、流動相、檢測器共同組成），其是個動態(tài)的結(jié)果。當臺經(jīng)確認的儀器（完成安裝確認IQ、設(shè)計確認DQ、運行確認OQ）在分析實驗室運行后，其性能必須經(jīng)過定期的性能確認PQ，或者按計量規(guī)程進行校準，確定其整機性能如儀器檢出限等符合性能標準。如在JJG 705-2014
液相色譜儀檢定規(guī)程中，其小檢測濃度即儀器檢出限的方法即信噪比法，通過進樣低濃度的標準溶液，再根據(jù)標準溶液峰高和基線噪音峰高的比值計算，具體計算公式與公式2是致的。
由此可知，信噪比法反映出的是方法驗證當時狀態(tài)下系統(tǒng)檢出限/定量限，而非對于方法的檢測限/定量限，在實際使用不能盲從于信噪比3/10的結(jié)果。如作者以在進行個工藝相關(guān)雜質(zhì)檢測HPLC分析方法驗證時，根據(jù)信噪比法計算的檢測限位1μg/ml、定量限為3μg/ml（驗證中S/N均大于10、均值在15左右），因此制定方法的標曲下限為5μg/ml，但在色譜柱使用幾個批次之后，發(fā)現(xiàn)標曲下限5μg/ml的S/N就已經(jīng)掉到10以下了，此時原檢測限的S/N肯定也有著很大的變化，完全沒有達到方法驗證中檢測限、定量限驗證的目的。
4、檢測限和定量限的解決方案
因為檢測限和定量限常用測量方法的局限性，因此我們并不需要限定信噪比=3或10，而只需要驗證方法的靈敏度符合要求。如通常檢測限應(yīng)低于限度的1/30，定量限應(yīng)低于限度的1/10，但當達不到該要求時，只要規(guī)定定量限比ICH規(guī)定的雜質(zhì)報告限低即可（如50%報告限）。
在檢測限的驗證中，可以通過加標的方法進行信噪比的確認，并可參考USP對于可檢測性的定義和確認步驟：
-1：配置個在限度濃度的雜質(zhì)標準品溶液；
-2：配置個添加了限度濃度的雜質(zhì)標準品的樣品標準品溶液；
-3：配置個添加了（限度濃度100%-由Horwitz方程估算%RSD）的雜質(zhì)標準品的樣品標準品溶液；
如果1≤2且3＜2，則差異可以被檢出；否則該方法不能勝任限度檢測。
定量限可考慮設(shè)置個低于限度數(shù)倍的低濃度樣品（如5倍），在響應(yīng)差的儀器中信噪比仍然遠大于10（如100），其回收率驗證與精密度驗證均符合規(guī)定，則可以認為該數(shù)字可以適用于后的日常檢測，如果檢測結(jié)果小于該值，則直接報告“小于該值”即可。如在采用熒光染色法測定外源性DNA殘留量中，ChP規(guī)定DNA殘留量在1.25～80ng/ml范圍內(nèi)，本法線性較好，因此供試品DNA殘留量在該范圍內(nèi)可定量測定；當DNA殘留量低于1.25ng/ml時應(yīng)為限量測定，表示為小于1.25ng/ml。
設(shè)計合理的定量下限對于方法的靈敏度有著很好的保證，在實際操作中只需要驗證定量下限的準確度和精密度符合要求即可。如在復(fù)雜基質(zhì)樣品中，通常以標曲下限作為定量下限，且定量下限的準確度和精密度要求可適當放寬，要求校正標樣回算的濃度般應(yīng)該在標示值的±15%以內(nèi)，定量下限處應(yīng)該在±20%內(nèi)，質(zhì)控樣品準確度均值般應(yīng)在質(zhì)控樣品標示值的±15%之內(nèi)，定量下限準確度應(yīng)在標示值的±20%范圍內(nèi)。
信噪比作為容易獲得的參數(shù)，在檢測限和定量限的測定中使用非常方便。主要需要考慮的是由于受儀器、色譜柱、試劑、泵系統(tǒng)、檢測器等的影響很大，方法的靈敏度存在著很大的風險。因此，可以分析方法標準操作規(guī)程SOP中規(guī)定靈敏度溶液的信噪比作為檢測有效的系統(tǒng)適用性標準，參見參考文獻[3]提供的范例：以有關(guān)物質(zhì)為例，如某組分的限度0.1%，方法驗證時0.05%水平下信噪比20，回收率驗證與精密度驗證均符合規(guī)定，該水平為日常檢測報告的低值，則在系統(tǒng)適用性試驗中應(yīng)確認該組分0.05%水平下信噪比不小于20。
5、小結(jié)
按照檢測限和定量限的常用測量方法如信噪比法的結(jié)果并不準確，其僅能反映在當條件下的儀器（系統(tǒng)）檢出/定量限。因此在分析方法驗證中，不能簡單地以信噪比3/10進行判定和驗證測限和定量限，而應(yīng)該根據(jù)標準限度和相關(guān)法律法規(guī)，綜合考慮分析方法的靈敏度要求，并可以在分析方法標準操作規(guī)程SOP中規(guī)定靈敏度溶液的信噪比作為檢測有效的系統(tǒng)適用性標準。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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