熒光定量PCR 因操作方便、運行速度快、實驗結(jié)果準-確，受到越來越多的分子生物學研究者青睞。在實驗技術(shù)成熟的-天，也許對你來說，蕞難得不是實驗技術(shù)上的問題——而是選擇哪一種熒光定量PCR儀——你要征詢實驗室成員的意見、分析實驗室目乃至將來的需求、平衡實驗室的預算，更要詳細研究各種富you惑力的宣傳資料。面對各種不同性能的產(chǎn)品，您又該如何選擇呢?
shou先建議大家走出認識熒光定量PCR的兩個誤區(qū)：
誤區(qū)一：
儀器通道越多越好
隨著PCR技術(shù)的成熟運用，多重擴增越來越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。從蕞初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如各個廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無所適從，就有人一不小心走進了“通道越多越好”的誤區(qū)。
在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時，為了確保實驗結(jié)果的精-確性和準-確性都要在實驗中使用ROX(一種熒光染料)或用的Reference dye ，這些熒光染料都必須單獨使用一個檢測通道。這樣以來，真正能檢測多重PCR熒光信號的有-效通道只有4個，而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠家的用的熒光染料或試劑開放的，有-效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購買確認熒光定量PCR儀器的有-效檢測通道尤為重要，不能單單只聽宣傳。
考慮多重熒光定量PCR的通道數(shù)的時候也應該從實驗室實際情況出發(fā)，多重PCR并非人人適用、人人可用，因為它使實驗復雜化了。
誤區(qū)二：real-time PCR儀無需梯度功能
對于使用染料法的定量PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經(jīng)驗公式計算熔解溫度(Tm值)，但運用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對于特殊片斷，經(jīng)驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準-確的結(jié)果，退火溫度細微的差異對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在zhi定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出z適合的反應條件。
不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的蕞佳反應溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。
使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優(yōu)化過程，簡化了摸索 PCR反應條件的繁瑣實驗，既節(jié)省實驗時間提高-效率，又節(jié)省實驗成本。
當我們走出誤區(qū)，想要選擇一款z適合自己需求的熒光定量PCR儀時我們又該關(guān)注些什么呢?
1、 儀器的檢測通量
在購買定量PCR儀的時候要根據(jù)實驗實的需要來選擇不同通量的儀器。目市面上的熒光定量PCR的檢測通量小到16個多到384個。如果進行一般的基因表達研究或病原體檢測，實在不必購買昂貴的儀器，96孔的通量足夠用;需要尋找要新藥靶點和疾病標記的實驗室可以考慮購買384孔板的儀器。假如經(jīng)費有限無法購買384孔板儀器的實驗室，可以考慮購買運行速度快(帶有FAST模塊)的96孔板熒光定量PCR儀。有了高通量的儀器，你會發(fā)現(xiàn)樣品的制備和小體系、多樣本的PCR體系構(gòu)建成為限制實驗速度和結(jié)果的頸瓶。
2、 硬件設計特點
熒光定量PCR儀主要有傳統(tǒng)的96孔板式、創(chuàng)新的離心式等，每種設計都有它的獨到之處但也都有無法避免的缺憾。
傳統(tǒng)的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大，而且無需特殊的耗材。有些傳統(tǒng)的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發(fā)、CCD檢測，這些光學結(jié)構(gòu)在96孔板的頂部，每個樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同——邊緣效應，對結(jié)果產(chǎn)生影響。為了保-證精-確、準-確的實驗結(jié)果，這類儀器在實驗過程中通常會使用ROX(一種熒光染料)或用的Reference dye作為參照校正實驗結(jié)果。鹵鎢燈的使用壽命短、更換成本較高已經(jīng)成為很多用戶頭痛的問題。在實驗過程中鹵鎢燈作為一種熱光源，產(chǎn)生較多熱能對實驗結(jié)果有一定的影響。CCD蕞大的優(yōu)點就是可以同時掃描所有樣品中的熒光信號，但是靈敏度較低，而且同時檢測樣品間的熒光信號存在干擾。
3、 運行速度
在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數(shù)中，升降溫速度也是廠家喜歡大力宣傳的指標。更快的升降溫，可以縮短反應進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應的時間，提高PCR的特異性。
4、 靈活性
大規(guī)模繁忙的實驗室設備固然讓人羨慕，但是常規(guī)實驗室同樣可以有精彩的選擇。現(xiàn)在的儀器供應商擁有眾多技術(shù)家，有的還能提供整個分子生物學的基礎研究平臺，不但了解、滿足您現(xiàn)在的需求，而且還考慮到了你可能變化的需求——升和更換模塊。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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