支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(小直徑0.2um)并獨(dú)立生活的微生物。約有1%可通過(guò)濾菌器。支原體無(wú)細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性。可為圓形、絲狀或梨形。
支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀(guān)察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無(wú)顆粒群或中央束。
支原體代謝需固醇類(lèi)物質(zhì)、部分種類(lèi)需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一種支原體都有自身持點(diǎn)。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7.6—8.0)，對(duì)酸耐受性差。對(duì)熱比較敏感，對(duì)一般抗生素不敏感。
支原體污染細(xì)胞后。培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁。多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解。因此易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢。甚至從培養(yǎng)器皿脫落。
為確定有無(wú)支原體污染可做如下檢酗：
①相差顯微境檢測(cè)：將細(xì)胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀(guān)察。支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。
②熒光染色法：熒光染色用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀(guān)察。具體方法如下：先將細(xì)胞接種蓋玻片上，在細(xì)胞未長(zhǎng)滿(mǎn)取出玻片，用不合酚紅的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗。置于用生理鹽水配濃度為50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min。向細(xì)胞面滴加pH5.5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀(guān)察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。
③電鏡檢查；用掃描電鏡方法簡(jiǎn)便快速。也可以利用透射電鏡。
④DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高。但方法較為復(fù)雜
支原體是一類(lèi)缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。它不同于細(xì)胞，也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)要求比細(xì)菌高。
細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)性問(wèn)題。在細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，支原體感染發(fā)生后能改變細(xì)胞的DNA,RNA及
蛋白表達(dá)，又不能通過(guò)可視法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，而且它對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)率影響較小，不易引起注意。國(guó)內(nèi)外研究表明，95％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無(wú)膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是常見(jiàn)的污染細(xì)胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細(xì)胞的支原體種類(lèi)是很多的，國(guó)外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。
支原體污染的來(lái)源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來(lái)的污染和用來(lái)制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。
組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個(gè)方面來(lái)預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保-證無(wú)菌；在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。支原體突出的結(jié)構(gòu)特征是沒(méi)有細(xì)胞壁，一般來(lái)講，對(duì)作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如 -內(nèi)酰胺類(lèi)、萬(wàn)古霉素等完-全不敏感；對(duì)多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對(duì)支原體有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)及一些氟喹諾酮；其他類(lèi)抗生素如氨基糖苷類(lèi)、氯霉素對(duì)支原體有較小抑制作用，所以常不用來(lái)作為支原體感染的化學(xué)治療劑。
對(duì)于支原體污染的細(xì)胞，可以采取補(bǔ)救措施：
1、抗生素排除法：可以用5-10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24-48小時(shí)，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，有時(shí)可能有效。推薦用量：慶大霉素 200ug/ml ,四環(huán)素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。對(duì)于支原體污染抗生素應(yīng)用，預(yù)防性應(yīng)用比污染后使用好。
2、 加溫除菌：根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。將受支原體污染的細(xì)胞置于41度中作用5-10小時(shí)可以殺滅支原體。但由于41度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞本身也有較大的影響，故處理，應(yīng)先-進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定出-大限度殺傷支原體而對(duì)細(xì)胞影響較小的處理時(shí)間。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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