本文主要介紹了真核細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)可能遇到的問題，包括可能的原因及對(duì)應(yīng)的解決方案。
1. 細(xì)胞培養(yǎng)不貼壁
可能原因
胰
蛋白酶消化過度
支原體污染
培養(yǎng)液中無貼壁因子
解決方法
① 縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度
② 分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體
③ 清潔支架和培養(yǎng)箱
2. 培養(yǎng)液PH變化過快
可能原因
CO2張力不對(duì)
培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊
NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足
培養(yǎng)液中鹽濃度不正確/li>
細(xì)菌、酵母或真菌污染
解決方法
① 按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對(duì)應(yīng)CO2濃度為5％到10％
② 改用不依賴CO2培養(yǎng)液。松開瓶蓋1/4圈
③ 加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度
④ 在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle’s鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hank’s鹽配制的培養(yǎng)液
⑤ 丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌
3. 細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢
可能原因
更換了不同培養(yǎng)液或血清
試劑保存不當(dāng)
培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染
培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞
解決方法
① 比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分
② 比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)
③ 增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度
④ 換入新鮮配制培養(yǎng)液，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液
⑤ 補(bǔ)加谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子
⑥ 用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄
⑦ 用抗生素除菌
4. 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)死亡
可能原因
培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2
培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大
細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷
培養(yǎng)液滲透壓不正確
培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積
解決方法
① 檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)CO2
② 檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度
③ 取新的保存細(xì)胞種
④ 檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓
注意：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為260–350mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。
5. 黑膠蟲污染
黑膠蟲污染常在培養(yǎng)條件改變、細(xì)胞接種密度降低、細(xì)胞狀態(tài)不佳時(shí)顯現(xiàn)，尤其在凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)可造成大量細(xì)胞死亡。
感染黑膠蟲細(xì)胞的表現(xiàn)
細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)的旺盛，小黑點(diǎn)會(huì)越來越少，反之則多
可以穿透濾膜，也可以通過細(xì)胞培養(yǎng)箱空氣進(jìn)行污染
換掖沖洗后也無多大作用
低倍鏡下觀察為黑色點(diǎn)狀，高倍鏡（400X）下作不規(guī)則布朗運(yùn)動(dòng)
解決方法
① 體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)更換好一點(diǎn)的血清
② 如果是貼壁細(xì)胞的話，可用無菌的PBS洗幾次，可一定程度上緩解。若是懸浮的話，可以向其中少加一點(diǎn)滋養(yǎng)細(xì)胞（從小鼠腹腔內(nèi)取的巨噬細(xì)胞），加滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)有黑膠蟲的剛復(fù)蘇的細(xì)胞很有一定作用
③ 在換液先加入生理鹽水并輕輕拍打，沖洗干凈后再加入細(xì)胞培養(yǎng)液，堅(jiān)持天天洗，細(xì)胞傳代時(shí)加生理鹽水再離心一次，稍微加大接種密度，一段時(shí)間后，黑膠蟲數(shù)目會(huì)顯著減少
④ 環(huán)丙沙星+哌拉西林，各10ug/ml，選擇片劑，1.5一盒/6片，每片含環(huán)丙沙星0.25g，磨成粉，PBS溶解，稀釋到適當(dāng)濃度，過濾，4度保存。哌拉西林用的注射粉劑，2.5g/瓶，溶解到相應(yīng)濃度，加入PBS和培養(yǎng)基中，可以觀察到黑膠蟲數(shù)量明顯減少。
6. 支原體污染
支原體污染表現(xiàn)
細(xì)胞形態(tài)改變，一般是有梭形變成圓形，不再貼壁生長(zhǎng)，漂浮光鏡下，可以看到細(xì)胞膜上吸附很多圓點(diǎn)，40*16倍下約有0.1mm，分布多集中于細(xì)胞核周圍和細(xì)胞邊緣，中間部位較少消化時(shí)可以看到圓點(diǎn)從細(xì)胞膜上游離出來，很多，還會(huì)動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)液變堿，有大量小黑點(diǎn)游離
解決方法
① 添加抗支原體劑量的pbs或者其他平衡鹽液進(jìn)行潤(rùn)洗，然后消化。
② 常規(guī)離心，用添加抗支原體（沙星類較為有效）的完-全培養(yǎng)液重懸，植入新的培養(yǎng)瓶
③ 培養(yǎng)并且密切觀察（抗支原體推薦使用的濃度及時(shí)間如下）
恩諾沙星 25μ/ml，治療時(shí)間一周
環(huán)丙沙星10μ/ml，治療時(shí)間兩周
司氟沙星10μ/ml，治療時(shí)間一周
治療時(shí)間滿后撤藥換用普通雙抗培養(yǎng)基或者無抗培養(yǎng)基，另外特別說明因?yàn)橐陨纤幬锞笹+-，所以添加的時(shí)候不需要再添加常規(guī)雙抗。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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