人們合成與生物相關(guān)的物質(zhì)是從尿素開(kāi)始的，1828年，德國(guó)化學(xué)家維勒人工合成了存在于生物體的這種有機(jī)物。在1960年我國(guó)科學(xué)家采用化學(xué)方法shou次成功地合成了具有生物活性的
蛋白質(zhì)——胰島素。隨著內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)用各種不同的載體在原核、真核系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白表達(dá)更為行之有效。而這其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展得為迅速、成熟。原核表達(dá)具有操作方便、快捷，需時(shí)較短，表達(dá)量大，適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。雖然也有缺少糖基化和表達(dá)后加工等問(wèn)題，當(dāng)有了其它多種表達(dá)系統(tǒng)后，原核系統(tǒng)仍是我們合成外源蛋白的shou選。
在網(wǎng)上看到有人把原核表達(dá)技術(shù)分成四個(gè)等：初次嘗試掃盲、亂棍打棗入門、系統(tǒng)優(yōu)化中和自成一體高手，覺(jué)得十分有意思。但是根據(jù)筆者自己的經(jīng)驗(yàn)以及耳聞目睹的一些經(jīng)歷告訴我：做表達(dá)？那是謀事在人，成事在天。有時(shí)候你把克隆做出來(lái)了，雙酶切鑒定沒(méi)問(wèn)題，測(cè)序沒(méi)問(wèn)題，可是就是看不到表達(dá)帶。原因當(dāng)然可以分析，實(shí)驗(yàn)也是可以改進(jìn)，但是竄改一下戈?duì)柼┑脑挘?ldquo;成功的實(shí)驗(yàn)都是一樣的，失敗的實(shí)驗(yàn)各有各的不幸。”在實(shí)驗(yàn)遇到瓶頸的時(shí)候要如何進(jìn)行分析，找到問(wèn)題的癥結(jié)是我們的實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵所在。在準(zhǔn)備進(jìn)行原核表達(dá)的時(shí)候需要考慮的因素很多，市面上可供選擇的載體、菌株也很多，要如何進(jìn)行正確的選擇，找到適合自己的載體是十分重要的。所以，現(xiàn)在要對(duì)目常用的一些載體進(jìn)行介紹，讓我們對(duì)其相關(guān)產(chǎn)品及其表達(dá)原理進(jìn)行了解，以方便實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
先來(lái)一些大腸桿菌表達(dá)的基本概念：一個(gè)完整的表達(dá)系統(tǒng)通常包括配套的表達(dá)載體和表達(dá)菌株，如果是特殊的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測(cè)等等。選擇表達(dá)系統(tǒng)通常要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)考慮，比如表達(dá)量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達(dá)產(chǎn)物的純化方法等等。主要?dú)w結(jié)在表達(dá)載體的選擇上。
表達(dá)載體：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)，終止密碼，融合Tag（如果有的話），復(fù)制子，篩選標(biāo)記/報(bào)告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)室之間交換得到免費(fèi)的載體。但是要小心，輾轉(zhuǎn)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室和多個(gè)實(shí)驗(yàn)室成員之手的載體是否保持原來(lái)的遺傳背景？MCS是否還是原來(lái)那個(gè)MCS？是我們要特別注意的。
復(fù)制子：通常表達(dá)載體都會(huì)選用高拷貝的復(fù)制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴(yán)謹(jǐn)方式復(fù)制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復(fù)制子的拷貝數(shù)高達(dá)500以上，是表達(dá)載體常用的。通常情況下質(zhì)粒拷貝數(shù)和表達(dá)量是非線性的正相關(guān)，當(dāng)然也不是越多越好，超過(guò)細(xì)胞的承受范圍反而會(huì)損害細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果碰巧需要2個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復(fù)制元是否相容的問(wèn)題。
篩選標(biāo)記和報(bào)告基因：氨芐青霉素抗性是常見(jiàn)的篩選標(biāo)記，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一個(gè)載體的篩選標(biāo)記用。四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微。抗性基因的選擇要注意是否會(huì)對(duì)研究對(duì)象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達(dá)篩選中要注意的問(wèn)題應(yīng)該就是LB倒板加抗生素的溫度，溫度過(guò)高容易導(dǎo)致抗生素失效。-天耐青霉素的超細(xì)菌泛濫，不知道是否有我們實(shí)驗(yàn)人員的功勞呢？大家“隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之有沒(méi)有經(jīng)過(guò)煮沸或者消毒等處理呢？從以的一針50萬(wàn)單位到現(xiàn)在100多萬(wàn)個(gè)單位，青霉素劑量似乎越來(lái)越大了。
對(duì)于做表達(dá)來(lái)說(shuō)，如果不是要研究啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，通常比較少關(guān)心或者用到報(bào)告基因吧。綠色熒光蛋白是chang用的報(bào)告基因了（注意選擇適用原核表達(dá)版本的GFP），其他還有半乳糖苷酶啊，熒光素酶啊等等。一些融合表達(dá)Tag也有報(bào)告基因的功能。
啟動(dòng)子、終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)
啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子的強(qiáng)弱是對(duì)表達(dá)量有決定性影響的因素。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達(dá)和誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)。lac和Tac，PL和PR，T7是chang用的啟動(dòng)子
組成型表達(dá)：表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，也就是一直努力不停表達(dá)目的蛋白的啟動(dòng)子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達(dá)通常表達(dá)量比較高，成本低，但是不適合表達(dá)一些對(duì)宿主細(xì)菌生長(zhǎng)有害的蛋白。因?yàn)檫^(guò)量或者有害的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，反過(guò)來(lái)影響表達(dá)量的積累。
誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)：表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長(zhǎng)期高表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，又可減少菌體蛋白酶對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)。另外也有啟動(dòng)子是組成型的，但是啟動(dòng)子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。
融合表達(dá)：表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽（Tag），表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達(dá)），方便后繼的純化步驟或者檢測(cè)。對(duì)于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達(dá)；而一般的基因多選擇小Tag以減少對(duì)目的蛋白的影響。His-Tag是廣泛采用的Tag。
分泌表達(dá)：在起始密碼和目的基因之間加入信號(hào)肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜，避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)度累積而影響細(xì)胞生長(zhǎng)，或者形成包含體，而且表達(dá)產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的周質(zhì)空間。
可溶性表達(dá)：大腸桿菌表達(dá)效率很高，特別是強(qiáng)啟動(dòng)子，目的蛋白來(lái)不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包含體容易純化但是復(fù)性效率不高。分泌表達(dá)可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。
轉(zhuǎn)錄終止子對(duì)外源基因在大腸桿菌中的高-效表達(dá)有重要作用——控制轉(zhuǎn)錄的RNA長(zhǎng)度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達(dá)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動(dòng)子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動(dòng)子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，Rho因子作用下使轉(zhuǎn)錄終止mRNA和根據(jù)模版上的對(duì)稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA。常見(jiàn)的是rrnB rRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。
核糖體結(jié)合位點(diǎn)：?jiǎn)?dòng)子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開(kāi)始延伸的一段堿基序列，其中能與rRNA16S亞基3＇端互補(bǔ)的SD序列對(duì)形成翻譯起始復(fù)合物是必需的，多數(shù)載體啟動(dòng)子下游都有SD序列，也有些載體沒(méi)有，適合自帶SD序列的基因表達(dá)，要留意。
表達(dá)菌株：我們往往容易忽視的一點(diǎn)。不同的表達(dá)載體對(duì)應(yīng)有不同的表達(dá)菌株，一些特別設(shè)計(jì)的菌株更有助于解決一些表達(dá)難題，這一點(diǎn)生物通會(huì)有門的介紹。同樣的，交換獲得的免費(fèi)菌株，要小心其遺傳背景是否已經(jīng)發(fā)生改變？當(dāng)心。
注：以上各種特性是可以相互組合的，不是排他的！
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
客服一
