免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）是利用
抗體特異性反應(yīng)純化富集目的
蛋白的一種方法。它采用固定在微珠支持物上的特定抗體，從復(fù)雜的混合物中，純化單一抗原的實(shí)驗(yàn)。早期做科研的老師們，一般都會(huì)選用瓊脂糖珠(也稱瓊脂糖樹脂)作為免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中的固相支持物的材料。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的更迭，磁珠已經(jīng)后來(lái)居上，在免疫沉淀和其他微量親和純化方法中占據(jù)重要位置。
那么，瓊脂糖珠和磁珠各有什么優(yōu)勢(shì)？具體實(shí)驗(yàn)中又該如何選擇呢？-天就帶大家探究一下吧！
瓊脂糖珠
瓊脂糖珠，結(jié)構(gòu)呈海綿狀，直徑 50-150 μm，通過與抗體結(jié)合，繼而結(jié)合靶蛋白。它能夠直接高-校、快速結(jié)合抗體，而不需借助特殊的業(yè)設(shè)備。此外，瓊脂糖樹脂呈多孔結(jié)構(gòu)，這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸，具有更高的結(jié)合載量。在純化大量蛋白的時(shí)候，瓊脂糖偶聯(lián)抗體是IP實(shí)驗(yàn)的完-美選擇。
值得注意的是，在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中，抗體的量常常不足以滿足瓊脂糖珠的飽和荷載量，沒有被抗體覆蓋的瓊脂糖珠的部分則可以自由地結(jié)合任何可粘附的物質(zhì)，這種非特異性結(jié)合升高引起背景信號(hào)升高，這時(shí)，“高荷載量?jī)?yōu)勢(shì)”會(huì)變成“高荷載量劣勢(shì)”。對(duì)裂解樣本進(jìn)行預(yù)處理操作，是去除非特異性結(jié)合物為簡(jiǎn)單有效的方法。不僅如此，多孔的結(jié)構(gòu)會(huì)帶來(lái)如下問題：
1.抗體被困在孔內(nèi)，難以洗去，因此需要大量的洗滌來(lái)降低背景。
2.免疫沉淀的洗滌是在微量離心管中進(jìn)行的，液體之間的交換通過移液槍來(lái)完成，很容易丟失樣品。
3.微球上的抗體與目標(biāo)蛋白接觸的慢，需要較長(zhǎng)的孵育時(shí)間。
4.較長(zhǎng)的孵育時(shí)間及大量的洗滌導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的機(jī)械及生物（蛋白酶水解）損失。
磁珠
與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結(jié)合僅-限于磁珠的表面。磁珠的直徑只有1-4 μm，明顯小于瓊脂糖珠，磁珠沒有多孔結(jié)構(gòu)，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合；同時(shí)還避免了多孔結(jié)構(gòu)帶來(lái)的弊端，結(jié)合磁力架快速分離沉淀和上清液，不但縮短了操作時(shí)間，也使操作更加自動(dòng)化，但是相對(duì)成本也較高。
為了能讓大家更加直觀的了解二者的使用性狀差異，小艾特異讓瓊脂糖珠和磁珠進(jìn)行了PK賽，下面向各位觀眾通報(bào)比賽結(jié)果：
第1場(chǎng)：結(jié)合能力—瓊脂糖珠勝！
解說(shuō)：由于瓊脂糖珠直徑較大且具有海綿狀結(jié)構(gòu)，因而比磁珠有更大的表面積和更大的結(jié)合能力。但是瓊脂糖珠的可變多孔徑會(huì)使抗體會(huì)落入孔內(nèi)，導(dǎo)致結(jié)合受限，尤其是超大蛋白(一般是蛋白復(fù)合物)的結(jié)合，并且抗體可能會(huì)在洗滌步驟(離心)中流失。另外，瓊脂糖珠的非特異性結(jié)合能力大于磁珠。
第二場(chǎng)：背景低—磁珠勝！
解說(shuō)：瓊脂糖珠的多孔結(jié)構(gòu)，可以吸附更多蛋白，當(dāng)然也包括雜蛋白，因此背景比較高，-好預(yù)處理一下再上樣。磁珠表面光滑，背景低，預(yù)處理這步可跳過。
第三場(chǎng)：抗體消耗—磁珠勝！
解說(shuō)：如果你的抗體比較貴，磁珠是個(gè)好選擇！
第四場(chǎng)：操作簡(jiǎn)單快速—磁珠勝！
解說(shuō)：由于瓊脂糖珠免疫沉淀需要較長(zhǎng)的孵育時(shí)間，預(yù)處理步驟和多次離心，所以其需要大量的手動(dòng)操作，總時(shí)間為1-1.5小時(shí)。相反，磁珠免疫沉淀反應(yīng)不需要離心，配合使用磁性分離架磁性分離，在30分鐘內(nèi)即可完成實(shí)驗(yàn)，因此可以在較短時(shí)間內(nèi)輕松處理并獲得較多樣本的分析數(shù)據(jù)。
第五場(chǎng)：自動(dòng)化程度—磁珠勝！
解說(shuō)：磁珠操作簡(jiǎn)便，因此可以使用自動(dòng)化免疫沉淀設(shè)備，不僅節(jié)省了工作量和時(shí)間，還可以應(yīng)用于高通量。
第六場(chǎng)：成本—瓊脂糖珠勝！
解說(shuō)：免疫沉淀中設(shè)計(jì)微珠的成本主要取決于免疫沉淀方法和每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)所需要的微珠量。
瓊脂糖珠：瓊脂糖珠必須通過離心濃縮在管底部，并在每次孵育和洗滌除去上清液，通常需要肉眼識(shí)別管底部的瓊脂糖珠，因此，每個(gè)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)至少需要使用 25-50 μL 的瓊脂糖珠。
磁珠：采用磁性分離，無(wú)需設(shè)定小體積的的磁珠使用量，用量?jī)H取決于目的蛋白和免疫沉淀抗體。
當(dāng)然，在使用瓊脂糖珠的過程中，可以使用過濾離心柱代替普通的微量離心管，該離心柱包含一個(gè)過濾器，允許通過短暫的離心使除珠子外的所有免疫沉淀成分流過，因此可以顯著減少每個(gè)反應(yīng)所需的瓊脂糖珠使用量。
總結(jié)：從PK賽的結(jié)果可以看出，瓊脂糖珠和磁珠各有優(yōu)劣。當(dāng)樣品體積< 2 mL，建議使用磁珠。在日常小型分離特定蛋白質(zhì)和蛋白復(fù)合物時(shí)，以及進(jìn)行手動(dòng)和自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn) IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP 和 Pull-down 反應(yīng)并立即用于后續(xù)檢測(cè)分析時(shí)，磁珠相對(duì)比較有優(yōu)勢(shì)；當(dāng)樣品體積> 2 mL，建議使用瓊脂糖珠。當(dāng)抗體成本較低并且想要純化大量目的蛋白用于多種下游分析時(shí)，瓊脂糖珠是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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