做分離純化工作的人都知道，選擇合適的填料是至關(guān)重要的。通過優(yōu)化組合找到高效的純化工藝，使用少的步驟達(dá)到
蛋白質(zhì)產(chǎn)量和純度的大化。下面看看一下填料選擇介紹。
1、測(cè)定-分子量、PI
當(dāng)目標(biāo)蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時(shí)，可用PAGE電泳方法或?qū)游龇椒右詼y(cè)定。分離范圍廣闊的Superose HR預(yù)裝柱很適合測(cè)定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質(zhì)在多個(gè)含不同PH緩沖液的試管中，可簡(jiǎn)易地測(cè)出PI，并選擇純化用緩沖液的佳PH。
2、選擇-層析方法
若對(duì)目標(biāo)蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：
1.使用通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質(zhì)如Superose、Sephacryl HR依據(jù)分子量將 樣品分成不同組份。
2.用含一配體或
抗體的親和層析介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)蛋白。亦可用各種活化偶聯(lián)介質(zhì)偶聯(lián)目標(biāo)蛋白的底物、受體等自制親和介質(zhì)，再用以結(jié)合目標(biāo)蛋白。一步即可得到高純度樣品。
3.體積大的樣品，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。
3、純化-大量粗品
處理大量原液時(shí)，為避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質(zhì)。擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)利用多種STREAMLINE介質(zhì)，直接從含破碎細(xì)胞或組織萃取物的發(fā)酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結(jié)合為一。提高回收率，縮短純化周期。
4、純化-硫酸氨樣品
硫酸氨沉淀方法常被用來初步凈化樣品，經(jīng)處理過的樣本處于高鹽狀態(tài)下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術(shù)，隨著介質(zhì)種類不斷增多，漸被融入各生產(chǎn)工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質(zhì)中選擇適合介質(zhì)及佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。
5、純化-糖類分子
固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素，可結(jié)合碳水化合物的糖類殘基，很適合用作分離糖化細(xì)胞膜組份、細(xì)胞、甚至亞細(xì)胞細(xì)胞器，純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質(zhì)，為俘獲整個(gè)細(xì)胞或大復(fù)合物，如膜囊等。
6、純化-膜蛋白
膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應(yīng)選用與目標(biāo)蛋白相反電荷者，避免在作離子交換時(shí)和目標(biāo)蛋白競(jìng)爭(zhēng)交換介質(zhì)，籍此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。
7、純化-單抗、抗原
單抗多為IgG。來源主要是腹水和融合瘤培養(yǎng)上清液。腹水有大量白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和宿主抗體等。Mabselect、Protein G和Protein A對(duì)IgG的Fc區(qū)有一性親和作用，能一步純化各種不同源的IgG。血清互補(bǔ)劑如小牛血清可先用蛋白G預(yù)處理，在培養(yǎng)除去IgG。重組蛋白A介質(zhì)Mabselect和rProtein A Sepharose FF對(duì)IgG有更高的載量和一性，基團(tuán)脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200，很容易去除。
疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG。宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細(xì)純化中去除。
純化IgG抗原有效的方法是用活化偶聯(lián)介質(zhì)如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯(lián)IgG，再進(jìn)一步獲取IgG抗原。
HiTrap IgM是用來純化融合瘤細(xì)胞培養(yǎng)的單抗IgM，結(jié)合量達(dá)5mg IgM。HiTrap IgY是門用來純化IgY，結(jié)合量達(dá)100mg純IgY。
8、純化-重組蛋白
1.重組蛋白在設(shè)計(jì)、構(gòu)建時(shí)應(yīng)已融入純化構(gòu)想。樣品多夾雜了破碎細(xì)胞或溶解產(chǎn)物，擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)STREAMLINE便很適合做粗分離。Amersham biosciences提供三個(gè)快速表達(dá)、一步純化的融合系統(tǒng)。
GST融合載體使要表達(dá)的蛋白和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化，再利用凝血酶或因子Xa切開。
2．蛋白A融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgG Sepharose 6 FF純化。
含組氨酸標(biāo)記（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金屬，在一般或變性條件（8M尿素）下透過組氨酸螯合融合蛋白。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。
9、純化-包涵體蛋白
包涵體蛋白往往需溶于6M鹽酸胍或8M尿素中。高化學(xué)穩(wěn)定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝膠過濾介質(zhì)很適合在變性條件下做純化。變性純化后的蛋白需要復(fù)性至蛋白的天然構(gòu)象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分別被發(fā)現(xiàn)有助包涵體蛋白的復(fù)性。一般包涵體蛋白樣品的純度越高，復(fù)性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質(zhì)很適合純化復(fù)性的粗品，并可以1MnaOH重生。此方法純化后的包涵體蛋白，復(fù)性回收率明顯提高。
10、包涵體蛋白固相復(fù)性
近年許多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質(zhì)上，一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質(zhì)。去除變性劑后，蛋白在介質(zhì)上成功復(fù)性，再將復(fù)性好的蛋白洗脫下來。固相復(fù)性避免了一般復(fù)性過程中蛋白質(zhì)聚體的形成，所以復(fù)性得率更高，而且無需大量稀釋樣品，并將復(fù)性和初純化合二為一，大大節(jié)省時(shí)間及提高回收率。
固相復(fù)性方法也被用于以HiTrap Chelating金屬螯合層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達(dá)的組氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素親和層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達(dá)的含多個(gè)賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預(yù)裝柱均可反復(fù)多次重復(fù)使用，比一般試劑盒更方便、耐用。
11、純化-中草藥有效成分
中藥的化學(xué)成分其復(fù)雜。傳統(tǒng)中藥多是煎熬后服用，有效成份多較為親水，包括生物堿、黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸、多糖、肽和蛋白質(zhì)。靈活及綜合性地利用多種層析方法。如離子交換、分子篩、反相層析，更容易分離到單一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠同時(shí)具備吸附性層析和分子篩功能，例：如用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來，二糖甙其次，單糖甙隨后，后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用于各種天然產(chǎn)物的分離，包括生物堿、甙、黃酮、醌類、內(nèi)脂、萜類、甾類等。
*生物堿在酸性緩沖液中帶正電，成為鹽，HiTrap SP陽離子交換層析柱可以分離許多結(jié)構(gòu)非常近似的生物堿。相反，黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸等可溶于偏堿的緩沖液中，在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。
*一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex，Sephacryl。若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可選擇新一代的Superdex。一般植物可能含水溶性、酸溶性、堿溶性多種多糖。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進(jìn)一步獲各組份純品。另外，多糖藥物需去除可引起過敏的蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)Sevag方法用丁醇脫蛋白需反復(fù)數(shù)十次。陰陽離子交換法可以一、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質(zhì)。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中藥有效成分的檢測(cè)、分離和放大制備。由于中藥的成分非常復(fù)雜，SOURCE反相層析可用范圍為PH1-14 ，并可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比傳統(tǒng)硅膠反相層析更易于工藝優(yōu)化及在位清洗，壽命也更長(zhǎng)。
12、純化-肽類
肽類的來源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解，但可從有機(jī)溶劑或促溶劑中復(fù)性，所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。Superdex Peptide HR是為肽分子純化設(shè)計(jì)的凝膠過濾預(yù)裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG。
13、純化-核酸、病毒
核酸的純化用于去除影響測(cè)序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA和PCR產(chǎn)物等。病毒也可視作核酸大分子，和質(zhì)粒DNA一樣，可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質(zhì)去除雜蛋白，再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。
14.純化-寡核苷酸
寡酸苷酸多應(yīng)用在反義(anti-sense)DNA、RNA測(cè)序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產(chǎn)物，并避免凝集和保護(hù)基的脫落。載量大大高過反相層析，可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。
15.脫鹽、小分子去除
使用凝膠過濾介質(zhì)Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，處理量可達(dá)床體積30%。只需在進(jìn)樣后收集1/3-1/2柱體積的洗脫液，就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子，簡(jiǎn)單直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整個(gè)過程一般可于數(shù)分鐘至半小時(shí)完成。Sephadex G25系列介質(zhì)為蛋白質(zhì)脫鹽而設(shè)計(jì)，預(yù)裝柱HiTrap Desalting（5ml）可用針筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在數(shù)分鐘為多至10ml樣品脫鹽。
16、疫苗純化
使用凝膠過濾介質(zhì)Sepharose 4FF純化疫苗，去除培養(yǎng)基中的雜蛋白，處理量可大于床體積10%。柱高一般40-70cm，整個(gè)過程約半至一小時(shí)。目使用此法生產(chǎn)的疫苗品種有乙肝、狂犬、出血熱、流感、肺結(jié)核、小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。
在下游純化中,可應(yīng)用不同層析技術(shù)在純化生物分子的同時(shí),去除各種污染物。
1、去除-內(nèi)毒素
內(nèi)毒素又稱熱原。含脂肪A、糖類和蛋白，是帶負(fù)電的復(fù)合大分子。
內(nèi)毒素的脂肪A部份有很強(qiáng)的疏水性。但在高鹽下會(huì)凝集，無法上疏水層析。利用疏水層析試驗(yàn)盒可選擇結(jié)合目標(biāo)蛋白的介質(zhì)而去除內(nèi)毒素。
內(nèi)毒素與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強(qiáng)結(jié)合。可在洗脫目標(biāo)蛋白后用高鹽緩沖液或NaOH去除。
利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶聯(lián)內(nèi)毒素底物如LAL，PMB，自動(dòng)成親合層析介質(zhì)結(jié)合內(nèi)毒素。內(nèi)毒素經(jīng)常是多聚體，凝膠過濾層析可有效地將之去除。
2、去除-蛋白中的核酸
大量核酸增加樣本黏度，令區(qū)帶擴(kuò)張，反壓增加，降低分辨率和流速。藥審和食檢對(duì)核酸含量也有嚴(yán)格限制。
胞內(nèi)表達(dá)蛋白的核酸問題尤其嚴(yán)重。核酸帶陰電荷，在初步純化時(shí)利用陽離子交換介質(zhì)如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads,SP或CM Sepharose FF,SP SepharoseXL結(jié)合目標(biāo)蛋白，可除去大量核酸。
核酸在高鹽下會(huì)和蛋白解離,疏水層析介質(zhì)很適合用來結(jié)合目標(biāo)蛋白,在純化蛋白的同時(shí)去除核酸。
利用核酸酶將核酸切成小片斷,用凝膠過濾做精細(xì)純化時(shí)便很容易去除了。
3、去除-病毒和微生物
病毒和微生物可成為病原,應(yīng)盡量減除。結(jié)合不同層析技術(shù)，使用注射用水，用NaOH定期進(jìn)行
儀器和凝膠的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。
病毒大都有脂外殼。可用與目標(biāo)蛋白電荷相反的S/D（solvent/detergent)處理，使病毒失活，如Triton和Tween。再用適當(dāng)?shù)碾x子交換介質(zhì)如CM Sepharose FF結(jié)合目標(biāo)蛋白，去除S/D。
其它污染物可以改變pH和離子強(qiáng)度使其從目標(biāo)分子中解離或失活，凝膠過濾介質(zhì)Superdex及多種吸附性介質(zhì)，SOURCE都是很好的精細(xì)純化介質(zhì),可去除多種微量污染物。
客服一
