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超濾法濃縮蛋白質溶液實驗
閱讀次數：488 發布時間：2022/8/3 13:31:32

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實驗方法原理超濾濃縮蛋白質是通過外力使蛋白質溶液通過濾膜而仍保留目的蛋白質的方法。實驗室超濾主要是針對小體積蛋白質溶液（幾毫升），用離心力的方法使溶液很容易通過濾膜。我們以 Amicon 系作為超濾的實例進行描述。這個方法不易引起蛋白質變性。

微型濃縮器初始容量有 2 ml 以及更小的，2 mg/ml 的牛血清蛋白（BSA）樣品 2 ml 離心 30 min 可使體積濃縮至 50 ul 以下，然而濃縮的時間依所用超濾膜的類型、緩沖液的組成以及蛋白質的種類和濃度等因素而定。通過向濃縮的蛋白質溶液中加入新緩沖液及再離心，能很方便地更換蛋白質溶液的緩沖液和脫鹽，四種型號濃縮器 Centricon-3、10、30 和 Centricon-100 分別能截留平均分子量為 3，10, 30 和 100 kD 的蛋白質組分。

實驗材料蛋白質溶液

試劑、試劑盒

儀器、耗材 Amicon Centricon 微型濃縮器磁力攪拌器和攪拌子

實驗步驟

1. 組裝 Centricon 微型濃縮器并加 2 ml 樣品到樣品池內；

2. 5000 × g 離心 30 min；

3. 去掉樣品池的過濾管，蓋上回收管；

4. 倒置濃縮器 1000 × g 離心 2 min；

5. 濃縮樣品將移入回收管。另外用少量緩沖液洗滌濾器，能較完全地回收蛋白質。

注意事項

1. 離心時間依樣品性質而定。一般含有甘油的黏性溶液或蛋白質濃度較高時，需要離心時間較長。

2. 在典型的蛋白質回收率可高達 90％以上。

3. 目的蛋白的分子置應大于濃縮器截流組分分子量的 30％～50％，以確保目的蛋白截留成功。

4. 不同的濾膜具有不同的平均孔徑，有利于根據蛋白質的大小選擇合適的濾膜去濃縮蛋白。

5. Centricon 微量濃縮器的設計適用于固定角度的離心轉頭。由恰當的離心轉頭角度，使樣品在達到死腔體積為 25～40 ul 時，不進一步濃縮，這樣防止了樣品被濾干。

6. 其他離心的超濾系統還有 Amicon Centriflo （7 ml 容積）和 Centriprep （15 ml 容積）兩種濃縮器。

7. 為了濃縮大體積的樣品，采用加壓超濾系統耗時較長。Amicon 生產的帶攪拌室超濾系統可適用于幾百毫升溶液的濃縮。更大體積時則使用螺旋狀的、蜂窩狀纖維、或盒型膜裝置。

8. Penefsky （1977）提出了一種可用于凝膠過濾脫鹽的簡單離心柱。