(一)標(biāo)準(zhǔn)考馬斯亮藍(lán)染色法
(1)電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中)；
(2)室溫下振搖溫育4h至過(guò)夜；
(3)去除
染色液，收集保存可重復(fù)使用20-40次：
(4)依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室溫振搖下脫色。靈敏度為0.1-0.5ug
蛋白/每條帶。注：使用加熱的染色液或脫色液可以縮短染色或脫色時(shí)間。將染色液或脫色液在微波爐或水浴中加熱，(大約50-60℃)，染色時(shí)間可縮短至20min,脫色時(shí)間約 1-2h。
(二)快速考馬斯亮藍(lán)染色法
(1)電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250(溶解于50%三氯乙酸中)；
(2)室溫下振搖溫育20min；
(3)去除染色液，收集保存可重復(fù)使用多次；
(4)加入數(shù)倍體積的脫色液(25%甲醇、7%乙酸)室溫振搖下脫色。必要時(shí)可更換脫色液。靈敏度為1.0ug蛋白/每條帶。
(三)凝膠銨銀染色法
(1)電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的50%乙醇和10%乙酸，振搖30min至過(guò)夜；
(2)去除50%乙醇和10%乙酸，用去離子水清洗凝膠。加入20%乙醇, 室溫振搖30min；
(3)去除20%乙醇，再加5倍體積的20%乙醇，室溫振搖30min；
(4)去除20%乙醇，將凝膠轉(zhuǎn)入通風(fēng)柜內(nèi)，加入5倍體積的用去離子水配制的5%戊二醛，室溫振搖30min；
(5)去除戊二醛，用去離子水清洗凝膠。加入5倍體積的20%乙醇，室溫振搖20min；
(6)去除20%乙醇，重復(fù)⑥兩次；
(7)去除20%乙醇，用去離子水清洗凝膠。再加入5倍體積的用去離子水，室溫溫育10min；
(8)去除去離子水，加入4倍體積新鮮配制的氨水/銀
溶液，室溫振搖30min。配制100ml：加1.4ml 14.8mol/L氫氧化銨到100ml水中，再加入190ul 10mol/L氫氧化鈉；放置渦旋器上緩緩加入1ml新鮮配制的硝酸銀溶液(0.8g硝酸銀/ml水)，直至出現(xiàn)沉淀物，但很快溶解；
(9)去除氨水/銀溶液，用去離子水清洗凝膠20min以上，其間更換水?dāng)?shù)次；
(10)去除水，加入5倍體積新鮮配制的0.005%檸檬酸，0.019%的甲醛。輕柔混勻，數(shù)分鐘內(nèi)條帶即顯現(xiàn)出。當(dāng)背景開(kāi)始變化時(shí)，去除顯影劑，用用去離子水清洗凝膠。在10%乙酸和20%乙醇中溫育凝膠，以終止反應(yīng)。靈敏度為1－10ng蛋白/每條帶。
注：操作時(shí)，應(yīng)戴手套并使用潔凈的玻璃器皿，以免污染，影響反應(yīng)的靈敏度。
(四)凝膠中性銀染色法
(1)電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的30%乙醇和10%乙酸，振搖30min至過(guò)夜；
(2)去除乙醇/乙酸溶液，加入5倍體積的30%乙醇, 室溫振搖30min；
(3)去除乙醇，再加5倍體積的30%乙醇，室溫振搖30min；
(4)去除乙醇，加入10倍體積的去離子水，室溫振搖10min；重復(fù)用去離子水清洗兩次；
(5)去除去離子水，加入4倍體積新鮮配制的0.1%硝酸銀溶液(用室溫下貯存于棕色瓶?jī)?nèi)的20%原液稀釋而得)，室溫振搖30min；
(6)去除硝酸銀溶液，用去離子水清洗凝膠20s；
(7)去除水，加入5倍體積的2.5%碳酸鈉和 0.02%的甲醛(pH<4.0),室溫振搖溫育，數(shù)分鐘內(nèi)條帶即顯現(xiàn)出。當(dāng)背景開(kāi)始變黑時(shí)，停止溫育；
(8)在1%乙酸內(nèi)清洗，停止反映。用去離子水清洗，更換數(shù)次，每次10min；靈敏度為1－10ng蛋白/每條帶。
(五)凝膠銅染色法凝膠銅染色法為考馬斯亮藍(lán)或銀染色法的替代染色方法
將凝膠氯化銅溶液中溫育，在Tris和SDS同時(shí)存在時(shí)可形成明顯的白色不透明的沉淀物。蛋白條仍然清晰，留下一個(gè)多肽分離模式的附染圖象。由于蛋白質(zhì)未結(jié)合在凝膠上，可通過(guò)EDTA去除Cu離子而得以洗脫，因而該方法特別適合需快速定位蛋白條帶用于免疫反應(yīng)，或進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)化學(xué)研究。其染色模式如同考馬斯亮藍(lán)或銀染色法的凝膠，易進(jìn)行拍照。
(1)電泳后，凝膠用蒸餾水短時(shí)清洗數(shù)次，每次30s,勿洗過(guò)長(zhǎng)時(shí)間；
(2)將凝膠轉(zhuǎn)入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的0.3mol/L CuCl2；
(3)室溫振搖５min，較厚的凝膠可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。當(dāng)CuCl2 進(jìn)入凝膠時(shí)，在不含蛋白的區(qū)域會(huì)出現(xiàn)白色沉淀；
(4)用蒸餾水清洗數(shù)分鐘，在黑色背景下觀察結(jié)果。靈敏度為10-100ng蛋白/每條帶(0.5mm厚的凝膠)或1ug蛋白/每條帶(1mm厚的凝膠)。注：將凝膠在0.25mol/L EDTA、0.25mol/L Tris溶液中溫育可使銅染逆轉(zhuǎn)
客服一
