詳細內容
【使用方法】
一、試劑準備（在試劑準備區進行）
1. 取出包裝盒中的各組分，室溫放置，待其完全融化，混勻后備用。
2. 根據待測樣本、陰性對照、陽性對照的數量，按下表1單反應體系配制方法，取相應量的試劑，充分混勻成PCR-Mix，按照20 μL/反應分裝到PCR反應管中，瞬時離心后備用。
表1：單反應體系配制方法
| 試劑 | 反應液 | 混合酶 |
| 用量 | 19 μL | 1 μL |
二、樣本準備（在樣本準備區進行）
1. 使用商品化的病毒核酸提取試劑盒，參照說明書進行操作，提取好的核酸樣本如不能立即檢測，建議-70℃以下保存。
2. 取出樣本后混勻，將陰性對照、待測樣本、陽性對照各5 μL加入到PCR反應管中混勻。
3. 蓋上管蓋，2000 rpm離心30。
4. 將PCR反應管轉移到擴增區進行上機。
三、PCR（在核酸擴增區進行）
1. 將上述PCR反應管按照實驗布局依次放入PCR儀對應檢測孔內，并記錄順序。
2. 按表2設置PCR擴增循環參數。
表2：PCR擴增相關參數
| 體系 | 反應體系設為25 μL | ||
| 信號采集 | 選擇FAM通道檢測H5亞型； 選擇CY5通道檢測H7亞型； 選擇ROX通道檢測H9亞型。 | ||
| PCR 反應 條件 | 階段 | 條件 | 循環數 |
| 逆轉錄 | 50℃：30 min | 1 | |
| 預變性 | 95℃：5 min | 1 | |
| PCR | 95℃：15 sec | 45 | |
| 60℃：30 sec （此階段結束時采集熒光信號） | |||
【結果分析】
表3：結果分析表
| 實驗成立 條件 | 陰性對照 | 三通道Ct＞38或者No Ct，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。 |
| 陽性對照 | 三通道Ct≤30且出現典型的S型擴增曲線。 | |
| 樣本結果 判定標準 | H5亞型 陽性 | FAM通道Ct≤35且出現典型的S型擴增曲線。 |
| H7亞型 陽性 | CY5通道Ct≤35且出現典型的S型擴增曲線。 | |
| H9亞型 陽性 | ROX通道Ct≤35且出現典型的S型擴增曲線。 |
| 結果可疑 | 任一通道35＜Ct≤38，建議復測，復測結果仍為可疑，且出現明顯指數增長，判為陽性。否則為陰性。 |
| 結果陰性 | Ct＞38或者No Ct，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。 |
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室，應嚴格按照國家有關基因擴增檢驗實驗室管理規范進行管理。
2. 各區域物品均為用，不得交叉使用，以免污染。檢測結束后，應立即對工作臺進行清潔消毒。
3. 吸取反應液時，應盡量避免產生氣泡。上機，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發造成結果不準確。
4. 檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有10%次氯酸的廢液缸內，檢測結束的PCR反應管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
5. 工作臺及各種實驗用品應定期用10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒。
6. 試劑使用應在常溫下充分融化并混勻。不同批號的試劑請勿混用，并在有效期內使用。
【儲存條件與有效期】
試劑盒應置于-20℃冷凍避光貯存；
試劑盒保存有效期為12個月；
試劑盒反復凍融次數不宜超過5次。
原創作者：上海遠慕生物科技有限公司
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