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點(diǎn)擊次數(shù)：526 發(fā)布時(shí)間：2024/11/18
產(chǎn)品名稱(chēng)：豬流行性腹瀉病毒/傳染性胃腸炎病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)試劑盒
規(guī) 格：50T/盒
反應(yīng)體積：25μL
試劑類(lèi)型：液體
【檢測(cè)原理】本試劑盒根據(jù)熒光 PCR 技術(shù)原理，針對(duì) PCR試劑盒設(shè)計(jì)特異性引物和 Taqman 探針，通過(guò)熒光 PCR 檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì) PCR試劑盒的檢測(cè)。
豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害大，所以及早確診對(duì)該病的防治具有特別重要的意義。豬流行性腹瀉病毒的傳統(tǒng)診斷方法主要有病毒的分離鑒定、免疫熒光抗體試驗(yàn)、免疫電鏡觀察和ELISA等方法。但這些方法操作過(guò)程繁瑣、操作難度大，所需要時(shí)間較長(zhǎng)，一性不強(qiáng)因此建立一種快速、高靈敏度的診斷方法對(duì)防治PEDV感染是十分必要的。
PEDV屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)，其基因組為單鏈正股RNA，其中膜蛋白(M)基因高度保守。本研究根據(jù)PEDV的M基因設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，提供了PEDV的快速、靈敏的鑒別診斷方法，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)疑似感染仔豬糞便或腸道組織樣品中的PEDV。
【使用方法】
一、試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）
1. 取出包裝盒中的各組分，室溫放置，待其完全融化，混勻后備用。
2. 根據(jù)待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照的數(shù)量，按下表1單反應(yīng)體系配制方法，取相應(yīng)量的試劑，充分混勻成PCR-Mix，按照20 μL/反應(yīng)分裝到PCR反應(yīng)管中，瞬時(shí)離心后備用。
表1：?jiǎn)畏磻?yīng)體系配制方法
| 試劑 | 反應(yīng)液 | 混合酶 |
| 用量 | 19 μL | 1 μL |
二、樣本準(zhǔn)備（在樣本準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）
1. 使用商品化的病毒核酸提取試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取好的核酸樣本如不能立即檢測(cè)，建議-70℃以下保存。
2. 取出樣本后混勻，將陰性對(duì)照、待測(cè)樣本、陽(yáng)性對(duì)照各5 μL加入到PCR反應(yīng)管中混勻。
3. 蓋上管蓋，2000 rpm離心30。
4. 將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行上機(jī)。
三、PCR（在核酸擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行）
1. 將上述PCR反應(yīng)管按照實(shí)驗(yàn)布局依次放入PCR儀對(duì)應(yīng)檢測(cè)孔內(nèi)，并記錄順序。
2. 按表2設(shè)置PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)。
表2：PCR擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)
| 體系 | 反應(yīng)體系設(shè)為25 μL | ||
| 信號(hào)采集 | 選擇FAM通道檢測(cè)H5亞型； 選擇CY5通道檢測(cè)H7亞型； 選擇ROX通道檢測(cè)H9亞型。 | ||
| PCR 反應(yīng) 條件 | 階段 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
| 逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃：30 min | 1 | |
| 預(yù)變性 | 95℃：5 min | 1 | |
| PCR | 95℃：15 sec | 45 | |
| 60℃：30 sec （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)） | |||
【結(jié)果分析】
表3：結(jié)果分析表
| 實(shí)驗(yàn)成立 條件 | 陰性對(duì)照 | 三通道Ct＞38或者No Ct，線形為直線或輕微斜線，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。 |
| 陽(yáng)性對(duì)照 | 三通道Ct≤30且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。 | |
| 樣本結(jié)果 判定標(biāo)準(zhǔn) | H5亞型 陽(yáng)性 | FAM通道Ct≤35且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。 |
| H7亞型 陽(yáng)性 | CY5通道Ct≤35且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。 | |
| H9亞型 陽(yáng)性 | ROX通道Ct≤35且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。 |
| 結(jié)果可疑 | 任一通道35＜Ct≤38，建議復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)結(jié)果仍為可疑，且出現(xiàn)明顯指數(shù)增長(zhǎng)，判為陽(yáng)性。否則為陰性。 |
| 結(jié)果陰性 | Ct＞38或者No Ct，線形為直線或輕微斜線，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。 |
【注意事項(xiàng)】
1. 使用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格按照國(guó)家有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范進(jìn)行管理。
2. 各區(qū)域物品均為用，不得交叉使用，以免污染。檢測(cè)結(jié)束后，應(yīng)立即對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔消毒。
3. 吸取反應(yīng)液時(shí)，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上機(jī)，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確。
4. 檢測(cè)過(guò)程中使用過(guò)的吸頭，應(yīng)直接打到盛有10%次氯酸的廢液缸內(nèi)，檢測(cè)結(jié)束的PCR反應(yīng)管，切忌開(kāi)蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
5. 工作臺(tái)及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒。
6. 試劑使用應(yīng)在常溫下充分融化并混勻。不同批號(hào)的試劑請(qǐng)勿混用，并在有效期內(nèi)使用。
【儲(chǔ)存條件與有效期】
試劑盒應(yīng)置于-20℃冷凍避光貯存；
試劑盒保存有效期為12個(gè)月；
試劑盒反復(fù)凍融次數(shù)不宜超過(guò)5次。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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