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點(diǎn)擊次數(shù)：522 發(fā)布時間：2024/11/18
本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù)，通過設(shè)計一對禽口蹄疫病毒A型特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對口蹄疫病毒A型的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【使用方法】
一、試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）
1. 取出包裝盒中的各組分，室溫放置，待其完全融化，混勻后備用。
2. 根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照的數(shù)量，按下表1單反應(yīng)體系配制方法，取相應(yīng)量的試劑，充分混勻成PCR-Mix，按照20 μL/反應(yīng)分裝到PCR反應(yīng)管中，瞬時離心后備用。
表1：單反應(yīng)體系配制方法
| 試劑 | 反應(yīng)液 | 混合酶 |
| 用量 | 19 μL | 1 μL |
二、樣本準(zhǔn)備（在樣本準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）
1. 使用商品化的病毒核酸提取試劑盒，參照說明書進(jìn)行操作，提取好的核酸樣本如不能立即檢測，建議-70℃以下保存。
2. 取出樣本后混勻，將陰性對照、待測樣本、陽性對照各5 μL加入到PCR反應(yīng)管中混勻。
3. 蓋上管蓋，2000 rpm離心30。
4. 將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行上機(jī)。
三、PCR（在核酸擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行）
1. 將上述PCR反應(yīng)管按照實驗布局依次放入PCR儀對應(yīng)檢測孔內(nèi)，并記錄順序。
2. 按表2設(shè)置PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)。
表2：PCR擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)
| 體系 | 反應(yīng)體系設(shè)為25 μL | ||
| 信號采集 | 選擇FAM通道檢測H5亞型； 選擇CY5通道檢測H7亞型； 選擇ROX通道檢測H9亞型。 | ||
| PCR 反應(yīng) 條件 | 階段 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
| 逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃：30 min | 1 | |
| 預(yù)變性 | 95℃：5 min | 1 | |
| PCR | 95℃：15 sec | 45 | |
| 60℃：30 sec （此階段結(jié)束時采集熒光信號） | |||
【結(jié)果分析】
表3：結(jié)果分析表
| 實驗成立 條件 | 陰性對照 | 三通道Ct＞38或者No Ct，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。 |
| 陽性對照 | 三通道Ct≤30且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。 | |
| 樣本結(jié)果 判定標(biāo)準(zhǔn) | H5亞型 陽性 | FAM通道Ct≤35且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。 |
| H7亞型 陽性 | CY5通道Ct≤35且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。 | |
| H9亞型 陽性 | ROX通道Ct≤35且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。 |
| 結(jié)果可疑 | 任一通道35＜Ct≤38，建議復(fù)測，復(fù)測結(jié)果仍為可疑，且出現(xiàn)明顯指數(shù)增長，判為陽性。否則為陰性。 |
| 結(jié)果陰性 | Ct＞38或者No Ct，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。 |
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室，應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理規(guī)范進(jìn)行管理。
2. 各區(qū)域物品均為用，不得交叉使用，以免污染。檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺進(jìn)行清潔消毒。
3. 吸取反應(yīng)液時，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上機(jī)，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確。
4. 檢測過程中使用過的吸頭，應(yīng)直接打到盛有10%次氯酸的廢液缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR反應(yīng)管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
5. 工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒。
6. 試劑使用應(yīng)在常溫下充分融化并混勻。不同批號的試劑請勿混用，并在有效期內(nèi)使用。
【儲存條件與有效期】
試劑盒應(yīng)置于-20℃冷凍避光貯存；
試劑盒保存有效期為12個月；
試劑盒反復(fù)凍融次數(shù)不宜超過5次。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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